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初級(jí)會(huì)員 | 第14年
熒光定量PCR(SYBR Green)總RNA提取方法步驟2023/12/04
總RNA提?。篈組織樣本:迅速將新鮮的組織切成合適的大小,在液氮中充分研磨后加裂解液裂解,或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1mlTrizol。B全血樣品:加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中,室溫孵育10min,室溫3500rpm離心6min。棄上清,原每2-3ml全血樣品加1mLTrizol。C細(xì)胞樣品:懸浮液中生長(zhǎng)的細(xì)胞,通過離心收集細(xì)胞后,每1×105?106細(xì)胞加入1mLTrizol,移液器吹打混勻,直接裂解或-80℃儲(chǔ)存一個(gè)月。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,有兩種處理方法。一
ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品正確溶解與稀釋2023/11/28
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計(jì)算的尺子,標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品正確溶解:1.粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心,讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。2.根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水,加水后輕柔渦旋震蕩,室溫靜置溶解10-30min,讓粉末全溶解。注意:加水后暫不用移液槍吹吸,避免蛋白未溶解,槍頭帶出部分蛋白,待全溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋:1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的選擇:若血清、血漿、組織勻漿樣本,用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。若細(xì)胞上清樣本,建議用細(xì)胞培養(yǎng)基梯度稀
ELISA試驗(yàn)陰性與陽(yáng)性對(duì)照平均值計(jì)算與判斷2023/11/20
陰性與陽(yáng)性對(duì)照平均值計(jì)算與判斷:1.陰性對(duì)照平均值NCx有效性計(jì)算判斷舉例:(1)第一類NCx計(jì)算與評(píng)價(jià):以HBsAg為例Ⅰ.設(shè)置3孔的NCx計(jì)算:NCx=(0.011+0.010+0.090)/3=0.010Ⅱ.任一個(gè)NC值應(yīng)≤0.100至≥-0.010;Ⅲ.各NC值也應(yīng)介于≥0.5×NCx至≤1.5×NCx之間。此時(shí)各孔的NC值均處于NCx±0.006范圍內(nèi),其中遇有一孔NC值偏離該范圍時(shí),則棄去該NC值,再計(jì)算NCx。如有2孔NC值超出該范圍時(shí),本次試驗(yàn)(無效)應(yīng)予復(fù)試。Ⅳ.不同廠牌對(duì)NC
原代培養(yǎng)操作步驟與注意事項(xiàng)2023/11/13
原代分離細(xì)胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后,經(jīng)機(jī)械以及消化分離成單個(gè)細(xì)胞或單一型細(xì)胞群,使之在體外模擬人體生理環(huán)境,在無菌、適當(dāng)溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)條件下,生存、生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)細(xì)胞常有不同的細(xì)胞成分,生長(zhǎng)緩慢,但是更能代表所來源的組織細(xì)胞類型和表達(dá)組織的特異性特征。利用原代細(xì)胞培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn),如藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗(yàn)效果很好。操作步驟:1、剪切組織:先將所取得的組織,用D-Hanks或Hanks液清洗,以去除表面血污,并用手術(shù)鑷去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后,用手術(shù)刀
ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品溶解與稀釋介紹2023/11/06
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡(jiǎn)稱,是一種檢測(cè)方法,而標(biāo)準(zhǔn)品是相對(duì)于具體的物質(zhì)有具體的標(biāo)準(zhǔn)品,所以不存在說ELISA的標(biāo)準(zhǔn)品。ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計(jì)算的尺子,標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。正確溶解、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品如下:1.粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心,讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。2.根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水,加水后輕柔渦旋震蕩,室溫靜置溶解10-30min,讓粉末*溶解。注意:加水后暫不用移液槍吹吸,避免蛋
小鼠ELISA檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)常見問題解答2023/10/30
小鼠ELISA檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)常見問題解答:1、問:小鼠ELISA檢測(cè)試劑盒后期數(shù)據(jù)處理中空白的OD值有什么作用?答:可以將標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值同時(shí)減去空白的值進(jìn)行計(jì)算,或者都不減,保持同一水平就行。2、問:那我們算出來的ACH含量為什么出現(xiàn)負(fù)值?答:說明個(gè)別樣本的濃度很低,當(dāng)濃度接近第6個(gè)點(diǎn)的時(shí)候,直線方程就有可能計(jì)算出負(fù)值。3、問:我兩個(gè)空白孔一個(gè)啥都不加,一個(gè)加了后面的A液,B液還有終止液,請(qǐng)問用哪一個(gè)?答:用加了A液,B液還有終止液的那個(gè)更加準(zhǔn)確,因?yàn)闃颖径技舆^這些,可以排除相應(yīng)的干擾。4
PCR反應(yīng)條件的控制與循環(huán)參數(shù)分析2023/10/23
PCR反應(yīng)條件的控制:1.PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子。2.鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高,常用1.5mmol/L。3.底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,20~200umol/L。4.TaqDNA聚合酶2.5U(100ul)。5.引物濃度一般為0.1~0.5umol/L。6.反應(yīng)溫度(1)變性溫度和時(shí)間95℃,30s。(2)退火溫度和時(shí)間低于引物Tm值5℃左右,一般在45~55℃。(3)延伸溫度和時(shí)間72℃,1min/kb(10kb內(nèi))。(4)Tm值=4(G+C)+2(A+
細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方式分享2023/10/16
目前,血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的的添加物,尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí),常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后,再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%,3%,1%,直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化,是否有部分細(xì)胞死亡,存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留,很少有細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前,要留有
化學(xué)實(shí)驗(yàn)室固體與液體試劑取用規(guī)范操作2023/10/11
化學(xué)試劑按照形態(tài)的差異分為固體、液體、粉末、顆粒等不同種類,針對(duì)不同的試劑需要選用符合其特性的試劑瓶,所以試劑在取用時(shí)也會(huì)有所差別。在各類化學(xué)實(shí)驗(yàn)、科研檢測(cè)過程中,正確、精準(zhǔn)地取用固體樣品和液體樣品是保證數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確的重要一步,所以,掌握藥品及試劑的取用、稱量和溶解就是非常必要的。一、固體試劑的取用規(guī)則1、要用干凈的藥匙取用。用過的藥匙必須洗凈和擦干后才能再使用,以免沾污試劑。2、取用試劑后立即蓋緊瓶蓋。3、稱量固體試劑時(shí),必須注意不要取多,取多的藥品,不能倒回原瓶。二、液體試劑的取用規(guī)則為了防
ELISA標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋操作要點(diǎn)2023/10/03
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計(jì)算的尺子,標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品,即是標(biāo)準(zhǔn)物品,作為一種衡量標(biāo)準(zhǔn),如果用在藥物方面,則為含量測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)含量。正確溶解、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品操作下面詳述:1.粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心,讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。2.根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水,加水后輕柔渦旋震蕩,室溫靜置溶解10-30min,讓粉末wan全溶解。注意:加水后暫不用移液槍吹吸,避免蛋白未溶解,槍頭帶出部分蛋白,待wan全溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。3.標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋:(1)標(biāo)準(zhǔn)品稀
蛋白質(zhì)定量分析實(shí)驗(yàn)詳解2023/09/22
蛋白質(zhì)的定量分析主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán),或與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來進(jìn)行的。目前常用的蛋白質(zhì)的定量主要有紫外線吸收法、Bradford法及BCA法等。實(shí)驗(yàn)原理:BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸)法測(cè)定蛋白的原理二價(jià)銅離子在堿性條件下可以被蛋白質(zhì)還原成一價(jià)銅離子(biuretreaction),一價(jià)銅離子和du特的BCA溶液A(含有BCA)相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)銅離子,形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性,
細(xì)胞冷凍保存方法?及注意事項(xiàng)2023/09/11
冷凍保存方法:1、傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘----20℃30分鐘----80℃16~18小時(shí)(或隔夜)---液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20℃不可超過1小時(shí),以防止胞內(nèi)冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。2、程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。3、步驟:(1)冷凍前24-48小時(shí)
熊源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒PCR反應(yīng)的特異性探討2023/09/08
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合;②堿基配對(duì)原則;③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性;④靶基因的特異性與保守性。1、其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。2、靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)
ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)包被過程詳解2023/08/28
在使用ELISA試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,需要注意很多問題,比如溫育、顯色、包被等問題。其中,包被是要特別注意的一個(gè)問題,直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的效果。一、包被的方式將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán),故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)
PCR常見種類推薦2023/08/16
PCR的概念:PCR,即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR),主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成:即模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,在DNA聚合酶和適宜的溫度下,兩條引物分別與兩條模板DNA鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火,接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)為底物,使退火引物得以延伸,如此反復(fù),使位于兩段已知序列之間的DNA丨片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。PCR的分類:PCR有很多種,核心就是用引物擴(kuò)增特定的DNA,以指數(shù)方式
探討載體保存微生物菌種方法2023/08/07
微生物菌種載體保存法,即將微生物吸附在適當(dāng)載體上進(jìn)行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種:1、土壤保存法主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液,立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥,然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜,土壤需風(fēng)干、粉碎、過篩和滅菌。使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是:取適量土壤(5克),置于塞有棉塞的試管中,加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤大持水量的60%為宜),然后高壓滅菌。再將需保存的
合成培養(yǎng)基的主要成分詳解2023/08/01
細(xì)胞培養(yǎng)基的種類很多,按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基),按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌,液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供,用戶可直接使用,非常方便。合成培養(yǎng)基的主要成分有:氨基酸、碳水化合物、無機(jī)鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)。1、氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異,但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成,必須依靠培養(yǎng)液提供,這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨
胎牛血清給細(xì)胞提供的作用2023/07/24
胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的添加培養(yǎng)基。它營(yíng)養(yǎng)豐富,大約含有三四百種不同成分,具有基礎(chǔ)培養(yǎng)基所不具備的營(yíng)養(yǎng)因子。它給細(xì)胞提供的益處主要有六個(gè)方面。1、提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的天然激素或天然的生長(zhǎng)因子。2、提供天然的結(jié)合蛋白,能識(shí)別氨基酸、脂質(zhì)、金屬離子和激素等,能結(jié)合并調(diào)節(jié)它們的活性。已知清蛋白(albumin)即具有上述功能,并對(duì)細(xì)胞代謝、生物合成、增殖和存活具有潛在的影響。又如胎牛血清中富含胎球蛋白(Fetuin),具有多個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn),因而能調(diào)節(jié)和維持血清中的鈣離子濃度。3、天然含有粘附蛋白等細(xì)
大腸桿菌概述及菌株的分型2023/07/17
大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡(jiǎn)單,培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì),倍受遺傳工程專家的重視.目前大腸桿菌是應(yīng)用zui廣泛,最成功的表達(dá)體系,常做高效表達(dá)的shou選體系。真核基因在大腸桿菌中表達(dá),必須有合適的表達(dá)載體(Vector),常用載體:pBV220,pET系統(tǒng)。一、目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的情況:大腸桿菌更適合原核基因的表達(dá),外源基因表達(dá)產(chǎn)量與單位體積產(chǎn)量是正相相關(guān)的,而單位體積產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和每個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量呈正相相關(guān).細(xì)胞濃度與生長(zhǎng)速率,外源基因拷貝數(shù)和表達(dá)
單克隆抗體和多克隆抗體從多方面分析區(qū)別2023/07/10
抗體是我們實(shí)驗(yàn)中zui常用到的一種物質(zhì)之一,抗體主要是分為單克隆抗體和多克隆抗體兩大類,本文從定義、制備方式、性質(zhì)特點(diǎn)及應(yīng)用上的區(qū)別對(duì)單抗和多抗進(jìn)行比較。一、定義上的區(qū)別機(jī)體受抗原刺激后,由淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞(主要是B淋巴細(xì)胞分化后的漿細(xì)胞)產(chǎn)生具有特異性免疫功能球蛋白,即抗體??乖镔|(zhì)上能刺激B淋巴細(xì)胞的結(jié)構(gòu)部位叫做抗原決定簇,一個(gè)抗原具備多個(gè)抗原決定簇,只針對(duì)一個(gè)抗原決定簇起作用的漿細(xì)胞群就是一個(gè)純系,即一種克隆,由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。機(jī)體受到抗原的刺激往往會(huì)針對(duì)抗原的多個(gè)抗
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