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熒光定量PCR(SYBR Green)總RNA提取方法步驟2023/12/04
總RNA提?。篈組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1mlTrizol。B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mLTrizol。C細(xì)胞樣品：懸浮液中生長的細(xì)胞，通過離心收集細(xì)胞后，每1×105?106細(xì)胞加入1mLTrizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲存一個月。貼壁生長的細(xì)胞，有兩種處理方法。一
ELISA實驗標(biāo)準(zhǔn)品正確溶解與稀釋2023/11/28
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計算的尺子，標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA實驗成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品正確溶解：1.粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心，讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。2.根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水，加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置溶解10-30min，讓粉末全溶解。注意：加水后暫不用移液槍吹吸，避免蛋白未溶解，槍頭帶出部分蛋白，待全溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋:1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的選擇：若血清、血漿、組織勻漿樣本，用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。若細(xì)胞上清樣本，建議用細(xì)胞培養(yǎng)基梯度稀
ELISA試驗陰性與陽性對照平均值計算與判斷2023/11/20
陰性與陽性對照平均值計算與判斷：1．陰性對照平均值NCx有效性計算判斷舉例：（1）第一類NCx計算與評價：以HBsAg為例Ⅰ.設(shè)置3孔的NCx計算：NCx=（0.011+0.010+0.090）/3=0.010Ⅱ.任一個NC值應(yīng)≤0.100至≥－0.010；Ⅲ.各NC值也應(yīng)介于≥0.5×NCx至≤1.5×NCx之間。此時各孔的NC值均處于NCx±0.006范圍內(nèi)，其中遇有一孔NC值偏離該范圍時，則棄去該NC值，再計算NCx。如有2孔NC值超出該范圍時，本次試驗（無效）應(yīng)予復(fù)試。Ⅳ.不同廠牌對NC
原代培養(yǎng)操作步驟與注意事項2023/11/13
原代分離細(xì)胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后，經(jīng)機(jī)械以及消化分離成單個細(xì)胞或單一型細(xì)胞群，使之在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定的營養(yǎng)條件下，生存、生長和繁殖。原代培養(yǎng)細(xì)胞常有不同的細(xì)胞成分，生長緩慢，但是更能代表所來源的組織細(xì)胞類型和表達(dá)組織的特異性特征。利用原代細(xì)胞培養(yǎng)做各種實驗，如藥物測試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗效果很好。操作步驟：1、剪切組織：先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手術(shù)鑷去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后，用手術(shù)刀
ELISA實驗標(biāo)準(zhǔn)品溶解與稀釋介紹2023/11/06
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱，是一種檢測方法，而標(biāo)準(zhǔn)品是相對于具體的物質(zhì)有具體的標(biāo)準(zhǔn)品，所以不存在說ELISA的標(biāo)準(zhǔn)品。ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計算的尺子，標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA實驗成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。正確溶解、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品如下：1.粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心，讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。2.根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水，加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置溶解10-30min，讓粉末*溶解。注意：加水后暫不用移液槍吹吸，避免蛋
小鼠ELISA檢測試劑盒實驗常見問題解答2023/10/30
小鼠ELISA檢測試劑盒實驗常見問題解答：1、問：小鼠ELISA檢測試劑盒后期數(shù)據(jù)處理中空白的OD值有什么作用？答：可以將標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值同時減去空白的值進(jìn)行計算，或者都不減，保持同一水平就行。2、問：那我們算出來的ACH含量為什么出現(xiàn)負(fù)值？答：說明個別樣本的濃度很低,當(dāng)濃度接近第6個點(diǎn)的時候,直線方程就有可能計算出負(fù)值。3、問：我兩個空白孔一個啥都不加，一個加了后面的A液，B液還有終止液,請問用哪一個？答:用加了A液，B液還有終止液的那個更加準(zhǔn)確,因為樣本都加過這些，可以排除相應(yīng)的干擾。4
PCR反應(yīng)條件的控制與循環(huán)參數(shù)分析2023/10/23
PCR反應(yīng)條件的控制：1.PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子。2.鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L。3.底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L。4.TaqDNA聚合酶2.5U(100ul）。5.引物濃度一般為0.1～0.5umol/L。6.反應(yīng)溫度（1）變性溫度和時間95℃，30s。（2）退火溫度和時間低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃。（3）延伸溫度和時間72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）。（4）Tm值=4(G+C)+2(A+
細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方式分享2023/10/16
目前，血清仍是動物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實驗后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有
化學(xué)實驗室固體與液體試劑取用規(guī)范操作2023/10/11
化學(xué)試劑按照形態(tài)的差異分為固體、液體、粉末、顆粒等不同種類，針對不同的試劑需要選用符合其特性的試劑瓶，所以試劑在取用時也會有所差別。在各類化學(xué)實驗、科研檢測過程中，正確、精準(zhǔn)地取用固體樣品和液體樣品是保證數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確的重要一步，所以，掌握藥品及試劑的取用、稱量和溶解就是非常必要的。一、固體試劑的取用規(guī)則1、要用干凈的藥匙取用。用過的藥匙必須洗凈和擦干后才能再使用，以免沾污試劑。2、取用試劑后立即蓋緊瓶蓋。3、稱量固體試劑時，必須注意不要取多，取多的藥品，不能倒回原瓶。二、液體試劑的取用規(guī)則為了防
ELISA標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋操作要點(diǎn)2023/10/03
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計算的尺子，標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA實驗成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品，即是標(biāo)準(zhǔn)物品，作為一種衡量標(biāo)準(zhǔn)，如果用在藥物方面，則為含量測定中的標(biāo)準(zhǔn)含量。正確溶解、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品操作下面詳述：1.粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心，讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。2.根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水，加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置溶解10-30min，讓粉末wan全溶解。注意：加水后暫不用移液槍吹吸，避免蛋白未溶解，槍頭帶出部分蛋白，待wan全溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。3.標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋:（1）標(biāo)準(zhǔn)品稀
蛋白質(zhì)定量分析實驗詳解2023/09/22
蛋白質(zhì)的定量分析主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán)，或與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來進(jìn)行的。目前常用的蛋白質(zhì)的定量主要有紫外線吸收法、Bradford法及BCA法等。實驗原理：BCA（bicinchoninicacid，二辛可酸）法測定蛋白的原理二價銅離子在堿性條件下可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子（biuretreaction），一價銅離子和du特的BCA溶液A（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，
細(xì)胞冷凍保存方法?及注意事項2023/09/11
冷凍保存方法：1、傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘----20℃30分鐘----80℃16～18小時(或隔夜)---液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。2、程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。3、步驟：（1）冷凍前24-48小時
熊源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒PCR反應(yīng)的特異性探討2023/09/08
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對原則；③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。1、其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2、靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)
ELISA試劑盒實驗包被過程詳解2023/08/28
在使用ELISA試劑盒進(jìn)行實驗的時候，需要注意很多問題，比如溫育、顯色、包被等問題。其中，包被是要特別注意的一個問題，直接關(guān)系到實驗的效果。一、包被的方式將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)
PCR常見種類推薦2023/08/16
PCR的概念:PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR），主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條引物分別與兩條模板DNA鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）為底物，使退火引物得以延伸，如此反復(fù)，使位于兩段已知序列之間的DNA丨片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。PCR的分類:PCR有很多種，核心就是用引物擴(kuò)增特定的DNA，以指數(shù)方式
探討載體保存微生物菌種方法2023/08/07
微生物菌種載體保存法，即將微生物吸附在適當(dāng)載體上進(jìn)行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種：1、土壤保存法主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風(fēng)干、粉碎、過篩和滅菌。使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是：取適量土壤(5克)，置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤大持水量的60%為宜)，然后高壓滅菌。再將需保存的
合成培養(yǎng)基的主要成分詳解2023/08/01
細(xì)胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實驗者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便。合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機(jī)鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)。1、氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨
胎牛血清給細(xì)胞提供的作用2023/07/24
胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的添加培養(yǎng)基。它營養(yǎng)豐富，大約含有三四百種不同成分，具有基礎(chǔ)培養(yǎng)基所不具備的營養(yǎng)因子。它給細(xì)胞提供的益處主要有六個方面。1、提供細(xì)胞生長所需的天然激素或天然的生長因子。2、提供天然的結(jié)合蛋白，能識別氨基酸、脂質(zhì)、金屬離子和激素等，能結(jié)合并調(diào)節(jié)它們的活性。已知清蛋白(albumin）即具有上述功能，并對細(xì)胞代謝、生物合成、增殖和存活具有潛在的影響。又如胎牛血清中富含胎球蛋白（Fetuin），具有多個鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，因而能調(diào)節(jié)和維持血清中的鈣離子濃度。3、天然含有粘附蛋白等細(xì)
大腸桿菌概述及菌株的分型2023/07/17
大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡單,培養(yǎng)條件簡單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì),倍受遺傳工程專家的重視.目前大腸桿菌是應(yīng)用zui廣泛,最成功的表達(dá)體系,常做高效表達(dá)的shou選體系。真核基因在大腸桿菌中表達(dá),必須有合適的表達(dá)載體(Vector),常用載體:pBV220,pET系統(tǒng)。一、目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的情況:大腸桿菌更適合原核基因的表達(dá),外源基因表達(dá)產(chǎn)量與單位體積產(chǎn)量是正相相關(guān)的,而單位體積產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和每個細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量呈正相相關(guān).細(xì)胞濃度與生長速率,外源基因拷貝數(shù)和表達(dá)
單克隆抗體和多克隆抗體從多方面分析區(qū)別2023/07/10
抗體是我們實驗中zui常用到的一種物質(zhì)之一，抗體主要是分為單克隆抗體和多克隆抗體兩大類，本文從定義、制備方式、性質(zhì)特點(diǎn)及應(yīng)用上的區(qū)別對單抗和多抗進(jìn)行比較。一、定義上的區(qū)別機(jī)體受抗原刺激后，由淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞(主要是B淋巴細(xì)胞分化后的漿細(xì)胞)產(chǎn)生具有特異性免疫功能球蛋白，即抗體。抗原物質(zhì)上能刺激B淋巴細(xì)胞的結(jié)構(gòu)部位叫做抗原決定簇，一個抗原具備多個抗原決定簇，只針對一個抗原決定簇起作用的漿細(xì)胞群就是一個純系，即一種克隆，由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。機(jī)體受到抗原的刺激往往會針對抗原的多個抗
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