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原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國(guó)

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史華進(jìn)冉良驥

隨著多肽合成技術(shù)的不斷發(fā)展和日趨成熟以及GLP-1受體激動(dòng)劑（如利拉魯肽和司美格魯肽）的走紅，肽類(lèi)藥物逐步成為眾多生物藥企重點(diǎn)關(guān)注的研發(fā)管線之一。由于多肽分子大小介于傳統(tǒng)小分子化藥和蛋白類(lèi)生物藥之間，因此具備兩者的一些特性。為指導(dǎo)化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)的研究，2月21日，國(guó)家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心發(fā)布《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，其在質(zhì)量研究與控制部分介紹了使用LCMS鑒別合成肽。賽默飛單桿液質(zhì)在線除鹽結(jié)合解卷積功能以及完善的液相色譜產(chǎn)品及解決方案，可以助力肽類(lèi)藥物的工藝研發(fā)及質(zhì)量研究和控制工作。

寡肽定義 

寡肽一般指由2-20個(gè)氨基酸殘基通過(guò)肽鍵連接形成的生物活性肽，通常也被稱(chēng)作小肽，低聚肽或者小分子活性肽。相較于小分子藥物，寡肽藥物具有更好的靶向性，而對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽，寡肽分子量更小，結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單更容易滲透到目標(biāo)組織。

合成肽中的雜質(zhì) 

固相肽合成技術(shù)因其效率高，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，已成為主流的肽合成技術(shù)。合成過(guò)程中難免會(huì)形成相關(guān)雜質(zhì)，包括合成工藝中氨基酸丟失，插入或錯(cuò)配，以及脫酰胺、氧化或異構(gòu)化等降解雜質(zhì)。

質(zhì)譜前端在線除鹽 

液相質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)作為現(xiàn)代常見(jiàn)的有機(jī)化合物定性手段，已被廣泛用于合成路線中主化合物及有關(guān)雜質(zhì)鑒定。雖然目前為止，TFA是主流的離子對(duì)試劑用于合成肽樣品分離，不過(guò)對(duì)于有些難分離的化合物依然需要采用磷酸鹽體系改善分離。質(zhì)譜使用者都熟知，像磷酸鹽這類(lèi)不揮發(fā)性鹽不能直接進(jìn)入質(zhì)譜，這對(duì)于直接用質(zhì)譜定性方法中的有關(guān)雜質(zhì)增加了難度。為了解決上述問(wèn)題，二維在線除鹽技術(shù)日趨流行。一維色譜保留原不揮發(fā)性鹽體系方法，二維采用揮發(fā)性的流動(dòng)相將目標(biāo)物送入質(zhì)譜鑒定。賽默飛雙三元液相色譜系統(tǒng)（圖1），采用獨(dú)特的雙泵設(shè)計(jì)，每個(gè)泵可作為一個(gè)單獨(dú)的運(yùn)行體系，有各自獨(dú)立的比例閥和流動(dòng)相體系，可同時(shí)分別控制三條流動(dòng)相流路，輕松實(shí)現(xiàn)二維在線除鹽功能。

圖1：雙三元泵外觀

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雙三元二維在線除鹽方法設(shè)計(jì) 

采用雙三元二維液相色譜系統(tǒng)構(gòu)建的質(zhì)譜前端在線除鹽流路如圖 2 所示，質(zhì)譜前端在線除鹽技術(shù)過(guò)程一般主要有三個(gè)步驟，主要利用柱溫箱上的兩個(gè)2位6通閥切換技術(shù)，控制不同流路間的聯(lián)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)首先對(duì)原來(lái)含有不揮發(fā)性鹽流動(dòng)相方法進(jìn)行重現(xiàn)，確定待切組分的出峰時(shí)間，設(shè)定切閥時(shí)間。由圖2可見(jiàn)，柱溫箱上閥帶有樣品收集環(huán)，本實(shí)驗(yàn)配置的樣品環(huán)為500 μL，結(jié)合一維色譜流速為1.0 mL·min?1，因此，最大的收集時(shí)間為0.5min，通過(guò)閥切換技術(shù)可以將目標(biāo)組分（流動(dòng)相含有不揮發(fā)性鹽或離子對(duì)試劑）收集于環(huán)中，非目標(biāo)組份可直接經(jīng)由閥排入廢液；然后收集好的組分會(huì)由配有質(zhì)譜兼容流動(dòng)相的雙三元左泵帶入在線除鹽小柱，目標(biāo)組分先保留在除鹽柱上，不揮發(fā)性鹽在除鹽柱上無(wú)保留，因此直接流入廢液。最后，待鹽全部流穿后，通過(guò)下閥閥切，改變左泵梯度，將目標(biāo)組分帶入質(zhì)譜儀進(jìn)行定性分析。

圖2 雙三元二維在線除鹽系統(tǒng)流路圖

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質(zhì)譜解卷積 

多肽分子使用電噴霧離子源（ESI）時(shí)，由于其存在多個(gè)潛在電荷位點(diǎn)，質(zhì)譜圖中會(huì)出現(xiàn)多個(gè)電荷對(duì)應(yīng)的不同m/z離子信號(hào)。通過(guò)這些離子峰不能直接獲取多肽分子的準(zhǔn)確分子量。根據(jù)多電荷離子碎片的質(zhì)荷比推算單電荷多肽的分子量這一方法被稱(chēng)為電荷解卷積，質(zhì)譜圖通過(guò)解卷積處理后可以直接獲得多肽的準(zhǔn)確分子量。

儀器配置 

Vanquish Core系列液相色譜儀：

雙三元泵：VC-P33-A-01；

自動(dòng)進(jìn)樣器：VC-A12-A-02；

柱溫箱：VC-C10-A-03（配置兩個(gè)2位6通閥，500uLloop環(huán)）；

DAD檢測(cè)器：VC-D11-A；

VWD檢測(cè)器：VC-D40-A；

ISQ單桿質(zhì)譜檢測(cè)器；

變色龍色譜管理軟件 Chromeleon CDS 7.3.1配備去卷積權(quán)限PN:7200.0046

結(jié)果與分析

按一維分析柱條件運(yùn)行一維色譜，可以得到一維紫外色譜圖。如圖3所示，主化合物出峰時(shí)間為35.947 min，在16.523 min處有一個(gè)雜質(zhì)，為此次實(shí)驗(yàn)研究雜質(zhì)。通過(guò)一維色譜圖可以確定樣品環(huán)的收集時(shí)間或閥切換時(shí)間，根據(jù)一維色譜出峰時(shí)間，設(shè)定第一次切閥時(shí)間為16.3min，即一維待測(cè)組分轉(zhuǎn)入樣品環(huán)，第二次閥切時(shí)間為16.8min，即二維流動(dòng)相將組分帶入除鹽柱，進(jìn)行在線除鹽，然后待鹽除去后，設(shè)置下閥切閥時(shí)間并調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，將待測(cè)物轉(zhuǎn)入質(zhì)譜。

圖3 寡肽樣品一維紫外檢測(cè)器色譜圖

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因質(zhì)譜不能使用不揮發(fā)性鹽流動(dòng)相，為盡可能降低其進(jìn)入后端質(zhì)譜風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)驗(yàn)前期采用紫外檢測(cè)器研究切閥及二維色譜條件，監(jiān)測(cè)待測(cè)物是否成功切入二維。由圖4可見(jiàn)，按二維除鹽柱條件運(yùn)行二維色譜，22分鐘前，在高比例水相條件下除去不揮發(fā)性鹽，然后26分鐘提高有機(jī)相比例，即將待測(cè)物成功轉(zhuǎn)入二維檢測(cè)器，在紫外檢測(cè)器中出鋒時(shí)間為26.94min，且峰形良好。

圖4 寡肽樣品二維紫外檢測(cè)器色譜圖

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待二維方法確認(rèn)后，將質(zhì)譜檢測(cè)器串聯(lián)到二維紫外檢測(cè)器后，按照色譜及質(zhì)譜條件運(yùn)行系統(tǒng)，如圖5所示，在質(zhì)譜總離子流色譜（TIC）中，待測(cè)雜質(zhì)峰出峰時(shí)間為27.0min且質(zhì)譜響應(yīng)較高。

圖5寡肽樣品二維質(zhì)譜檢測(cè)器總離子流圖

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通過(guò)Chromeleon數(shù)據(jù)處理軟件去卷積功能，可通過(guò)去卷積算法，將系列離子峰轉(zhuǎn)化為單個(gè)分子質(zhì)量。圖6中展示了軟件通過(guò)算法可以獲得離子峰對(duì)應(yīng)的電荷數(shù)分布及該寡肽的分子量。

圖6 變色龍軟件去卷積處理后待測(cè)雜質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果

（1）進(jìn)樣序列；（2）目標(biāo)組分列表；（3）去卷積參數(shù)設(shè)置；（4）和（6）總離子流圖；（5）全掃描質(zhì)譜圖；（7）去卷積譜圖；（8）源質(zhì)譜圖；（9）去卷積結(jié)果組成列表。（點(diǎn)擊查看大圖）

小結(jié)

利用雙三元二維液相儀器，一個(gè)泵模塊，可以發(fā)揮兩個(gè)泵的功能，開(kāi)展在線除鹽技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省臺(tái)面空間。除鹽后，組分可以直接進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器，進(jìn)行后續(xù)定性工作。整個(gè)過(guò)程完全自動(dòng)化，可以確保實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性，提高分析效率，節(jié)省時(shí)間。數(shù)據(jù)采集后，結(jié)合變色龍軟件質(zhì)譜去卷積功能，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可以快速獲取寡肽樣品有關(guān)化合物的電荷分布及分子量結(jié)果。因此，本研究可以輔助寡肽合成工藝，獲取目標(biāo)峰分子量，為寡肽合成終點(diǎn)控制，中間體控制，雜質(zhì)確證，合成路線優(yōu)化等工作提供指導(dǎo)意義。

參考資料：

《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》

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