W3110(DE3) 大腸桿菌感受態(tài)細胞
產(chǎn)品信息：
組成 BC217-01
W3110(DE3) 20×100?l
pUC19 質(zhì)粒 5?l
儲存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品說明：
W3110(DE3)來源于 K-12 菌株， 細菌的染色體 DNA 上整合了 T7 RNA 聚合酶(T7RNP)表達框原件， T7RNP 位于 lacUV5 啟
動子下，可表達 T7 RNA 聚合酶。pET、pGEX、pMAL 等原核表達載體可使用該菌株進行外源重組蛋白的表達。W3110(DE3)感
受態(tài)細胞由特殊工藝制作，pUC19 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率大于 1×106 cfu/μg DNA。
基因型: F -λ - rph-1INV(rrnD, rrnE)( lavUV5::T7 polymerase)
菌株抗性：對氨芐、、、、和四環(huán)素敏感。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟：
1. 將感受態(tài)細胞置于冰水浴中化凍。待細胞剛化凍后，加入質(zhì)粒 DNA 或 5-10μl 連接產(chǎn)物到細胞中，用手指管底，輕輕混勻；
2. 冰水浴中放置 30 分鐘，不要晃動；
3. 42℃熱擊 60 秒鐘，不要晃動；
4. 冰水浴中放置 2 分鐘，不要晃動；
5. 加入 500μl 無菌的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基；
6. 置于 37℃搖床中，150-200rpm 震蕩復(fù)蘇培養(yǎng) 60 分鐘；
7. 取 50-100μl 菌液涂布在含有抗性的 LB 平板上。待液體吸干后，倒置平板，37℃培養(yǎng) 12-16 小時。
（平板劃線分離法：復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后，12000rpm 離心 30 秒鐘，棄掉上清，留 100μl 左右的液體，用 200μl 吸頭輕輕吹打散菌塊，
取 10μl 重懸的菌液分多點滴在平板上，傾斜吸頭，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在平板上的液體來回劃線。這個方法可以獲得更多更大
的單克隆菌落。）
（質(zhì)粒快速轉(zhuǎn)化步驟：將步驟 2 的時間縮短到 5 分鐘，對于氨芐抗性的質(zhì)粒，步驟 4 完成后，可直接涂布或劃線于含氨芐青
霉素抗性的 LB 平板上。其它抗性的質(zhì)粒仍需 60 分鐘的復(fù)蘇培養(yǎng)。）
蛋白表達步驟：
1.挑取單菌落，接種到含 5ml 帶抗生素的 LB 培養(yǎng)基中；
2.37℃，200rpm 震蕩培養(yǎng)細菌至對數(shù)生長期（OD600=0.4-0.8）；
3.加入 IPTG 到終濃度為 0.4mM，37℃誘導(dǎo) 2-4 小時或 16℃誘導(dǎo)過夜；
4.誘導(dǎo)完成后，離心收集菌體，用合適的方法（如考馬斯亮藍染膠法，Western-Blot 法或酶活性分析法）分析菌體裂解物的總蛋白、
上清和沉淀組分，明確表達產(chǎn)物的表達狀況（可溶性或不溶性表達）；
5.大量表達時，可用 10ml 過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到 1L 培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)到 OD600=0.4-0.8 時，加入終濃度為 0.4mM 的 IPTG，37℃誘導(dǎo)2-4 小時或 16℃誘導(dǎo)過夜（不同蛋白表達的條件有所不同，需在實驗中優(yōu)化。


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重組蛋白：多項發(fā)明，原核表達系統(tǒng)穩(wěn)定表達蛋白 1000 余種。