實(shí)驗共分以下4個主要步驟:

1.細(xì)胞鋪盤

HeLa S3細(xì)胞，密度為80%左右分盤，使鋪盤密度在50%左右， 為滿足流式細(xì)胞儀上機(jī)要求，細(xì)胞數(shù)目需大于1x10組。2.細(xì)胞同步化處理:

a)加入終濃度2mM的Thymidine同步化18h

b)用溫育的PBS洗4次，更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)9h

c)再加入2mM Thymidine再次同步化18h后

3.樣品收集;

a)分別收取釋放2h(S期)，6h(G2/M期)和12h(G1期)細(xì)胞樣品

b)每個樣品收取都使用預(yù)冷的PBS洗滌4次，1000g離心5min, 棄上清

c) 100uL PBS重懸沉淀，吸取出細(xì)胞懸液于移液器中，于移去細(xì)胞的管中加入900μl預(yù)冷的70%乙醇，旋渦振蕩器震蕩中滴入細(xì)胞懸液。

d) 4C固定一小時或更 長時間。

e) 1500rmp，離心10min,去固定液。

f)細(xì)胞染色液配制: 50xRNase A母液: 50xPI母液: PBS=20: 20: 960; RNase A母液濃度1mg/mL，工作濃度20μg/mL; PI母液濃度2.5mg/mL, 工作濃度50μg/mL 。

g)細(xì)胞37度染色1h。根據(jù)細(xì)胞童，加入一定體積的細(xì)胞染色液(1~1.5mL) 重懸，使上機(jī)時細(xì)胞通過率為

200~350Cl/s，,染色液不可過多或過少，過多則細(xì)胞密度過低上機(jī)速度嚴(yán)重不足，過少則導(dǎo)致細(xì)胞粘結(jié)。

h) 300目篩網(wǎng)過濾至流式管中。

4.上機(jī)檢測;

流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計數(shù)50000個細(xì)胞。

5.同步化數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用ModFit軟件分析。