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用水浴鍋做腫瘤細胞軟克隆實驗

閱讀:1620      發(fā)布時間:2018-12-12
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       在傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成試驗中,細胞生長在上層含有細胞培養(yǎng)基的軟瓊脂中,下層軟瓊脂也與細胞培養(yǎng)基混合,但含有較高濃度的瓊脂。這可以防止細胞貼附在培養(yǎng)板上,還可以使轉(zhuǎn)化細胞形成可見的菌落。這種技術的原理是正常細胞依靠細胞與細胞外基質(zhì)的接觸才能生長和分裂,相反,不管周圍環(huán)境如何,轉(zhuǎn)化細胞均具有生長和分化的能力,因此能夠以錨定獨立的方式形成菌落的細胞被認為是轉(zhuǎn)化和致癌的。下面喆圖小編介紹一種用水浴鍋做相關實驗的方法,這種方法的總體目標是以半定量和嚴格的方式測定細胞的這種能力。

 

        實驗操作:

準備材料和試劑:

1、配制2×培養(yǎng)基:1 g培養(yǎng)基粉末,0.2 g碳酸氫鈉,加入去離子水,定容到50 mL。

2、將培養(yǎng)基經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌。

3、加入目標細胞所需培養(yǎng)基的其他成分。例如:用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CMT 167細胞需要加入10% FBS,1% 青霉素/鏈霉素。使用之前將培養(yǎng)基放在37°C水浴鍋中。

4、配制1×培養(yǎng)基,依照目標細胞生長所需培養(yǎng)基配制。

5、配制1%瓊脂:1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

6、配制0.6%瓊脂:0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

7、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌,滅菌后可放在4°C保存,使用前加熱至*溶解。

8、配制氯化硝基四氮唑藍試劑:1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍加入到1×PBS中。

 

        鋪下膠:

1、將熔化的1%瓊脂溶液和預熱的2×培養(yǎng)基放入裝滿熱水(42°C)的桶(或水浴鍋)中,在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內(nèi)。

2、6孔板中的每個孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養(yǎng)基,為保證足夠的量,一個6孔板準備12 mL。

3、首先加入6 mL的培養(yǎng)液到50 mL的錐形管,再加入6 mL的1%瓊脂溶液。將錐形管多次翻轉(zhuǎn)混勻,每個孔中迅速加入1.5 mL混合液,加混合液時不能產(chǎn)生氣泡。

4、室溫靜置30 min,待下膠凝固。

 

        鋪上膠:

1、收獲的細胞用胰蛋白酶消化,用培養(yǎng)基以1:5的比例稀釋(如1 mL胰蛋白酶,加4 mL培養(yǎng)基),放入15 mL錐形管。

2、細胞計數(shù):以每孔5000個細胞作為起始,并根據(jù)需要進行調(diào)整。

3、細胞懸浮液的體積需要1.5 mL。一個6孔板準備12 mL細胞懸液。

4、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水(42°C)的桶中,在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內(nèi)。

5、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細胞懸液,吸取6 mL細胞懸浮液到50 mL錐形管,再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液?;靹蚝笱杆偌尤?孔板中,每孔1.5 ml。小心避免產(chǎn)生氣泡。

6、室溫靜置30 min,待上膠凝固后放入細胞培養(yǎng)箱。

7、足夠的菌落形成所需的時間因每個細胞系而異,通常為21天左右。每星期加兩次100 g的培養(yǎng)基以防止干燥。

        以上內(nèi)容僅供參考,詳情請咨詢上海喆圖。

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