大鼠分泌型磷脂酶（sPLA2）試劑盒

大鼠分泌型磷脂酶（sPLA2）試劑盒是科研中用于檢測(cè)大鼠樣本里 sPLA2 水平的常用工具，對(duì)探索炎癥、代謝等生理病理機(jī)制意義重大。其類型多樣，各有特點(diǎn)與適用場(chǎng)景。

• 常見類型與原理

• ELISA 試劑盒：運(yùn)用雙抗體夾心法。將純化的大鼠 sPLA2 抗體包被在微孔板上作為固相抗體，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加入后，其中的 sPLA2 與固相抗體結(jié)合，再加入生wu素化的 sPLA2 抗體，形成 “固相抗體 - sPLA2 - 生wu素化抗體" 復(fù)合物，之后加入 HRP 標(biāo)記的親和素，親和素與生wu素特異性結(jié)合，使 HRP 連接到復(fù)合物上。洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)后，加入底物 TMB，在 HRP 催化下，TMB 由無色變?yōu)樗{(lán)色，加酸后轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，顏色深淺與 sPLA2 含量正相關(guān)。通過酶標(biāo)儀在 450nm 波長測(cè) OD 值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品濃度。例如，上海喬羽生物的大鼠 sPLA2 ELISA 試劑盒就采用該原理，質(zhì)量可靠，靈敏度佳 。

• 免疫組化試劑盒：利用抗原抗體特異性結(jié)合，以 HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物為基礎(chǔ)。樣本中 sPLA2 與一抗結(jié)合，生wu素化二抗再與一抗結(jié)合，最后加入 HRP - SA，形成復(fù)合物。復(fù)合物中的 HRP 催化底物顯色，可在顯微鏡下觀察 sPLA2 在細(xì)胞、組織內(nèi)的分布與定位，幫助研究其在組織中的作用。如上海莼試生物技術(shù)有限公司的相關(guān)試劑盒，靈敏性和高效性較高 。

• 化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒：以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原。當(dāng)與樣本中的 sPLA2 結(jié)合后，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)，光信號(hào)強(qiáng)度與 sPLA2 含量成正比。該方法靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，能精準(zhǔn)定量，像檢測(cè)大鼠 c - fos 的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒采用雙抗體夾心法，在檢測(cè)大鼠生物分子方面具有優(yōu)勢(shì)，可類推用于大鼠 sPLA2 檢測(cè) 。

• 樣本處理

• 血清：用無熱原和內(nèi)毒素試管收集血液，室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過夜，使血液凝固后，1000g 離心 20 分鐘，取上清即得血清。若不馬上檢測(cè)，需 - 20℃或 - 80℃保存，避免反復(fù)凍融，以防 sPLA2 活性或結(jié)構(gòu)改變。

• 血漿：可選用 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等抗凝。標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)，1000g 離心 15 分鐘，取上清獲血漿。保存條件同血清。

• 細(xì)胞上清液：細(xì)胞培養(yǎng)物 1000g 離心 20 分鐘，去除細(xì)胞和顆粒物質(zhì)，取上清。如需保存，遵循血清保存方式。

• 組織勻漿：將組zhi剪碎，加適量生理鹽水，用組織勻漿器勻漿，使細(xì)胞破碎釋放 sPLA2。然后 1000g 離心 30 分鐘，取上清用于檢測(cè)，保存方法同血清 。

• 操作流程

• 準(zhǔn)備工作：實(shí)驗(yàn)前，從冰箱取出試劑盒平衡至室溫（20 - 25℃），不可在 37℃快速溶解。準(zhǔn)備好酶標(biāo)儀、微量加液器、吸頭、EP 管、蒸餾水、濾紙等器材。

• 加樣：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准?100μl 樣品稀釋液；標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 100μl；待測(cè)樣品孔加處理后的樣本 100μl。加樣時(shí)避免氣泡，加到酶標(biāo)板底部，輕晃混勻。加樣后，酶標(biāo)板加蓋或覆膜，37℃溫育，如 2 小時(shí) 。

• 洗滌：溫育后棄去孔內(nèi)液體，甩干，每孔加約 400μl 洗滌緩沖液，浸泡 1 - 2 分鐘后甩干，重復(fù) 3 - 5 次。若用洗板機(jī)，按操作規(guī)程適當(dāng)增加洗滌次數(shù) 。

• 加酶標(biāo)試劑：每孔加 100μl 檢測(cè)溶液 A 工作液（臨用前配制），覆膜 37℃溫育 1 小時(shí)，洗滌。再每孔加 100μl 檢測(cè)溶液 B 工作液（臨用前配制），覆膜 37℃溫育 1 小時(shí)，再次洗滌 。

• 顯色：每孔加 90μl 底物溶液（底物 A 和底物 B 按 1:1 等體積混合），覆膜 37℃避光顯色 15 - 30 分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔前 3 - 4 孔有明顯梯度藍(lán)色，后 3 - 4 孔梯度不明顯時(shí)，終止顯色 。

• 終止反應(yīng)與讀數(shù)：每孔加 50μl 終止液，溶液由藍(lán)變黃。立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測(cè) OD 值 。

• 結(jié)果計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品 OD 值在曲線上查濃度，若樣品稀釋過，需乘以稀釋倍數(shù)得到實(shí)際含量 。

• 注意事項(xiàng)

• 試劑盒保存：2 - 8℃低溫保存，避免陽光直射和高溫，保質(zhì)期通常 6 - 12 個(gè)月，使用前檢查有效期，過期試劑盒易導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn) 。

• 樣本質(zhì)量：采集樣本避免溶血、脂血、微生物污染。溶血樣本中血紅蛋白等會(huì)干擾結(jié)果，脂血樣本脂肪顆粒影響吸光度。嚴(yán)格按說明書處理和保存樣本 。

• 操作規(guī)范：嚴(yán)格依說明書操作，精準(zhǔn)控制加樣量、孵育時(shí)間、洗滌次數(shù)、溫度等參數(shù)。加樣用校準(zhǔn)后的微量加液器；孵育保證溫度穩(wěn)定；洗滌要充分但不過度 。

• 避免交叉污染：使用一次性吸頭、EP 管，吸取不同溶液及時(shí)更換吸頭，防止樣本或試劑交叉污染，確保結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù) 。

• 底物和終止液使用：底物溶液見光易分解，避光保存，操作迅速。終止液有腐蝕性，注意防護(hù)，避免接觸皮膚和眼睛，若接觸立即大量清水沖洗并就醫(yī) 。