大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-B試劑盒

大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-B試劑盒，通常用于體外定量檢測(cè)大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中 SP-B 的含量，在呼吸生理與病理研究中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

檢測(cè)原理

試劑盒組成

1. 酶標(biāo)板：已包被抗大鼠 SP-B 抗體，常見(jiàn)規(guī)格有 96 孔和 48 孔。如某些品牌 96 孔板為 12 孔 ×8 條，48 孔板為 12 孔 ×4 條，方便實(shí)驗(yàn)操作與靈活選擇 。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：為已知濃度的 SP-B 凍干品或溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如某試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 100ng/mL，臨用前需用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解，并進(jìn)行系列倍比稀釋?zhuān)纬扇?100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL 等不同濃度梯度 。

3. 樣品稀釋液：用于稀釋樣本，保證樣本中 SP-B 濃度處于試劑盒可檢測(cè)的線性范圍 。

4. 檢測(cè)溶液：包含生wu素化的抗 SP-B 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素等。如檢測(cè)溶液 A 和檢測(cè)溶液 B，使用前需用相應(yīng)檢測(cè)稀釋液按比例稀釋 。

5. 底物溶液：一般分為底物 A 和底物 B，如 TMB 底物溶液，二者混合后在辣根過(guò)氧化物酶催化下發(fā)生顯色反應(yīng)，由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色，再經(jīng)酸作用變?yōu)辄S色 。

6. 洗滌緩沖液：多為濃縮液，使用時(shí)按一定比例用蒸餾水稀釋?zhuān)糜谙礈烀笜?biāo)板，去除未結(jié)合物質(zhì)，降低背景干擾 。

7. 終止液：通常為強(qiáng)酸溶液，如 2mol/L 的硫酸，用于終止底物顯色反應(yīng)，使反應(yīng)體系顏色穩(wěn)定，便于酶標(biāo)儀準(zhǔn)確讀取 OD 值 。

8. 覆膜或封板膜：防止反應(yīng)過(guò)程中液體蒸發(fā)及外界污染，維持反應(yīng)體系穩(wěn)定性 。

9. 使用說(shuō)明書(shū)：詳細(xì)闡述試劑盒組成、實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟、注意事項(xiàng)、結(jié)果計(jì)算方法等，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)人員規(guī)范操作 。

樣本處理

1. 血清：采用無(wú)熱原和內(nèi)毒素試管收集血液，收集后室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜，待血液充分凝固，以 1000g 離心 20 分鐘，小心吸取上清即得血清。若不立即檢測(cè)，應(yīng)將血清置于 - 20℃或 - 80℃保存，且避免反復(fù)凍融，以免影響 SP-B 活性或?qū)е碌鞍捉Y(jié)構(gòu)改變 。

2. 血漿：可選用 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等作為抗凝劑。標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)，以 1000g 離心 15 分鐘，取上清獲得血漿。血漿保存條件與血清一致 。

3. 組織勻漿：將組zhi剪碎，加入適量生理鹽水，使用組織勻漿器勻漿，使組織細(xì)胞破碎釋放 SP-B。勻漿后以 1000g 離心 30 分鐘，取上清用于檢測(cè)，保存方式同血清 。

操作流程

1. 準(zhǔn)備工作：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒從冰箱取出，平衡至室溫（20 - 25℃），不可在 37℃快速溶解。同時(shí)準(zhǔn)備好酶標(biāo)儀、微量加液器及吸頭、EP 管、蒸餾水或去離子水、濾紙等實(shí)驗(yàn)器材 。

2. 加樣：分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准尤霕悠废♂屢?100μl；標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 100μl；待測(cè)樣品孔加入處理后的樣本 100μl。加樣時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，將樣品加至酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加樣完成后，酶標(biāo)板加蓋或覆膜，置于 37℃溫育，如溫育 2 小時(shí) 。

3. 洗滌：溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，甩干。每孔加入洗滌緩沖液（按說(shuō)明書(shū)要求稀釋好）約 400μl，浸泡 1 - 2 分鐘后甩干，也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干。重復(fù)洗滌操作 3 - 5 次，確保che底去除未結(jié)合物質(zhì)。若使用洗板機(jī)，需按操作規(guī)程適當(dāng)增加洗滌次數(shù) 。

4. 加酶標(biāo)試劑：每孔加入檢測(cè)溶液 A 工作液 100μl（臨用前配制），酶標(biāo)板覆膜，37℃溫育 1 小時(shí)。溫育結(jié)束后再次洗滌，然后每孔加入檢測(cè)溶液 B 工作液 100μl（臨用前配制），覆膜，37℃溫育 1 小時(shí)，之后再次洗滌酶標(biāo)板 。

5. 顯色：每孔加入底物溶液（底物 A 和底物 B 按 1:1 等體積混合）90μl，酶標(biāo)板覆膜，37℃避光顯色。顯色時(shí)間需嚴(yán)格控制，一般 15 - 30 分鐘，當(dāng)觀察到標(biāo)準(zhǔn)孔的前 3 - 4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3 - 4 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止顯色反應(yīng) 。

6. 終止反應(yīng)與讀數(shù)：每孔加入終止液 50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。終止液加入順序盡量與底物液加入順序相同。立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD 值） 。

7. 結(jié)果計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的 OD 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品 OD 值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的濃度，若樣品進(jìn)行了稀釋?zhuān)璩艘韵鄳?yīng)稀釋倍數(shù)，從而得到樣品中 SP-B 的實(shí)際含量 。

注意事項(xiàng)

1. 試劑盒保存：試劑盒應(yīng)在 2 - 8℃低溫保存，避免陽(yáng)光直射與高溫環(huán)境。不同品牌保質(zhì)期略有差異，一般為 6 - 12 個(gè)月，使用前需檢查是否在有效期內(nèi)，過(guò)期試劑盒可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確 。

2. 樣本質(zhì)量：采集樣本時(shí)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，避免樣本溶血、脂血或被微生物污染。溶血樣本中釋放的血紅蛋白等物質(zhì)可能干擾檢測(cè)結(jié)果；脂血樣本中的脂肪顆?？赡苡绊懳舛葴y(cè)定，造成結(jié)果偏差。同時(shí)，樣本處理和保存應(yīng)嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，確保樣本中 SP-B 的活性和含量不受影響 。

3. 操作規(guī)范：嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，精確控制加樣量、孵育時(shí)間、洗滌次數(shù)和溫度等關(guān)鍵參數(shù)。加樣時(shí)使用經(jīng)校準(zhǔn)的微量加液器，保證加樣量準(zhǔn)確；孵育過(guò)程確保溫育溫度穩(wěn)定，可使用恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋，并定期校準(zhǔn)溫度；洗滌時(shí)既要保證充分洗滌，又要避免過(guò)度洗滌導(dǎo)致已結(jié)合物質(zhì)被洗脫 。

4. 避免交叉污染：實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用一次性吸頭、EP 管等耗材，避免不同樣本或試劑間交叉污染。吸取不同溶液時(shí)及時(shí)更換吸頭，特別是在吸取標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和不同試劑時(shí)，防止溶液相互污染，保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性 。

5. 底物和終止液使用：底物溶液對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存，使用時(shí)快速操作，減少與光接觸時(shí)間。終止液具有腐蝕性，操作時(shí)注意防護(hù)，避免接觸皮膚和眼睛，若不慎接觸，立即用大量清水沖洗，并及時(shí)就醫(yī) 。