上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司專業(yè)供應(yīng)各種屬elisa試劑盒，提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀真實(shí)性。我公司對(duì)試劑盒質(zhì)量100%保證，若存在質(zhì)量問(wèn)題，我們無(wú)條件包退換。若需要了解試劑盒的詳細(xì)信息，請(qǐng)來(lái)的咨詢：：    
業(yè)務(wù):   何

D二聚體（Ddimer，DD）是纖溶酶水解交聯(lián)纖維蛋白后形成的特異性降解產(chǎn)物，是體內(nèi)高凝狀態(tài)和繼發(fā)纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物之一。近年來(lái)，定量檢測(cè)DD含量已成為排查深靜脈血栓（DVT）、肺栓塞（PE）、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）等血栓性疾病的重要手段之一，并作為溶血栓治療的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)[1]。目前對(duì)DD的主要定量檢測(cè)方法為膠體金法（免疫滲濾法）和免疫比濁法?，F(xiàn)根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）相關(guān)文件，對(duì)兩種定量檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)與比較。

1 材料與方法

　　1.1 儀器與試劑

　　1.1.1 免疫比濁法采用美國(guó)IL公司生產(chǎn)的ACL TOP全自動(dòng)血凝儀及其配套DD檢測(cè)試劑（批號(hào)：B50317）;

　　1.1.2 膠體金法采用挪威AxisShield公司生產(chǎn)的Nycocard Reader 血漿DD檢測(cè)光度計(jì)，及配套DD膠體金免疫滲濾試劑盒（批號(hào)：10122111）。

　　1.1.3 干擾物：膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品（上海科華公司生產(chǎn)，批號(hào)：GF 62 K）、脂肪乳（主要成分為甘油三酯，華瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0510019）、血紅蛋白（日本試藥株式會(huì)社）。

　　1.2 標(biāo)本

　　1.2.1 質(zhì)控品：IL公司提供的正常及高值質(zhì)控血漿;

　　1.2.2 血樣：隨機(jī)抽取住院病人及健康體檢人群新鮮全血，用109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝， 3 000 r/min離心10 min，取得乏血小板血漿，3 h內(nèi)完成檢測(cè)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（批內(nèi)精密度）：根據(jù)CLSI的EP5A2文件[2]對(duì)于精密度評(píng)價(jià)的要求，分別采用免疫比濁法和膠體金法，在ACL TOP血凝儀與Nycocard Reader 光度計(jì)上測(cè)定正常及高值水平質(zhì)控血漿DD含量。3 h內(nèi)各水平連續(xù)測(cè)定20次，計(jì)算均值（）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）、變異系數(shù)（CV）。

　　1.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（日間精密度） 按上述方法，分別測(cè)定正常及高值質(zhì)控血漿DD含量，每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定20 d，計(jì)算、s、CV。

　　1.3.3 線性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)CLSI [3]對(duì)線性評(píng)價(jià)的要求及免疫比濁法和膠體金法各自的線性范圍，選取DD的高值和低值病人標(biāo)本，低值標(biāo)本為1號(hào)，高值標(biāo)本為5號(hào)，二者3∶1混合為2號(hào)，等份混合為3號(hào)，1∶3混合為4號(hào)，制備成5個(gè)濃度梯度的樣品，每個(gè)濃度樣品重復(fù)檢測(cè)4次，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析。

　　1.3.4 生物性物質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn) 根據(jù)CLSI EP7A文件[4]對(duì)干擾實(shí)驗(yàn)的相關(guān)要求，在體外向正常人混合血漿中加入不同濃度膽紅素、脂肪乳、血紅蛋白，加入的zui高濃度參考臨床標(biāo)本可能出現(xiàn)的zui高含量及試劑說(shuō)明書的說(shuō)明。分別使用免疫比濁法和膠體金法測(cè)定混合血漿，根據(jù)加入干擾物質(zhì)前后的測(cè)定值計(jì)算影響度。

　　影響度=（加入后測(cè)定值-加入前測(cè)定值）/加入前測(cè)定值×100%。

　　1.3.5 比對(duì)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)CLSI EP9A2文件[5]對(duì)能力比對(duì)的相關(guān)要求，選取隨機(jī)的住院病人新鮮全血標(biāo)本40例，采用上述兩種方法平行檢測(cè)DD含量，每天8例血漿，連續(xù)檢測(cè)5 d。zui后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

　　1.3.6 免疫比濁法與膠體金法DIC診斷效能的評(píng)價(jià)與比較：收集129例臨床疑為DIC的患者標(biāo)本，分別采用兩種方法檢測(cè)其FDP含量，以1999年全國(guó)DIC診斷標(biāo)準(zhǔn)修訂方案作為確診標(biāo)準(zhǔn)[6]，由此評(píng)價(jià)與比較兩種方法的診斷效能，包括受試者工作特征曲線（Receiver operating Characteristic Curve，ROC）、敏感度、特異度等。

　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 線性評(píng)價(jià)中根據(jù)理論值與實(shí)測(cè)值做相關(guān)曲線及回歸方程，獲得相關(guān)系數(shù)、截距、斜率等參數(shù);DIC診斷效能評(píng)價(jià)中采用四格表計(jì)算敏感度、特異度。以上處理及ROC繪制均使用SPSS 11.0軟件分析。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 重復(fù)性與穩(wěn)定性 比濁法和膠體金法的重復(fù)性與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)免疫比濁法重復(fù)性與穩(wěn)定性要優(yōu)于膠體金法。表1 ： DD批內(nèi)及日間精密度測(cè)定結(jié)果DD

　　2.2 抗生物物質(zhì)干擾 血漿的血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素含量分別為0 g/L、80 mg/dl、1 mg/dl，加入不同濃度干擾物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。脂肪乳中三酰甘油含量由AEROSET生化分析儀（雅培公司，美國(guó)）測(cè)定。結(jié)果表明，血紅蛋白達(dá)50 mg/dl、膽紅素達(dá)5 mg/dl對(duì)膠體金法檢測(cè)DD無(wú)影響，但在三酰甘油達(dá)450 mg/dl以上（中到高度脂血）時(shí)無(wú)法正確完成檢測(cè);血紅蛋白達(dá)50 mg/dl、三酰甘油達(dá)900 mg/dl、膽紅素達(dá)5 mg/dl對(duì)免疫比濁法檢測(cè)DD影響度均<6%。

　　2.3 線性實(shí)驗(yàn) 各自試劑說(shuō)明書，免疫比濁法檢測(cè)DD線性范圍為200~1 050 ng/ml，選取的高低值標(biāo)本測(cè)得DD含量分別為975 ng/ml、175 ng/ml，計(jì)算得回歸方程為y = 0.974x+5.296，相關(guān)系數(shù)（r）為0.997;膠體金法理論檢測(cè)范圍為100~20 000 ng/ml，選取的高低值標(biāo)本測(cè)得DD含量分別為8 000 ng/ml、300 ng/ml，計(jì)算得回歸方程為y=0.989x+118.68，相關(guān)系數(shù)（r）為0.994。結(jié)果表明膠體金法至少在300~8 000 ng/ml范圍內(nèi)仍能保持較好的線性;免疫比濁法線性范圍較小，但可通過(guò)自動(dòng)稀釋樣品檢測(cè)高濃度DD。表2 生物干擾物對(duì)DD檢測(cè)的影響干擾物

　　2.4 比對(duì)實(shí)驗(yàn) 將檢測(cè)結(jié)果作回歸曲線，得到免疫比濁法與膠體金法比對(duì)結(jié)果的回歸方程：y = 0.3085x + 748.06，相關(guān)系數(shù)r=0.938。根據(jù)CLSI文件要求（r>0.975），可見(jiàn)兩種方法相關(guān)性不理想。

　　2.5 兩種方法的DIC診斷效能 129例患者zui終確診為DIC的30例，非DIC 99例。兩種方法診斷DIC的ROC見(jiàn)圖1。曲線下面積分別為0.893（95%可信區(qū)間0.836~0.950），0.899 （95%可信區(qū)間0.841~0.956）;以DD含量500 ng/ml為診斷閾值，免疫比濁法的診斷敏感度與特異度分別為100%、42.6%，膠體金法分別為96.7%、46.1%。

　　3 討 論

　　臨床對(duì)深靜脈血栓（DVT）、肺栓塞（PE）等的早期排查，及對(duì)溶血栓治療的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)均需要一種對(duì)DD快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)方法。目前膠體金法與免疫比濁法作為DD定量檢測(cè)方法，得到越來(lái)越多的應(yīng)用。膠體金法檢測(cè)DD的原理為：加入的樣品中DD分子被包被有DD特異性單克隆抗體的濾過(guò)膜吸附，隨后加入DD單克隆抗體與膠體金的偶聯(lián)物溶液，膜上的DD與抗體金偶聯(lián)物發(fā)生三明治型結(jié)合反應(yīng)，并產(chǎn)生顏色變化，此時(shí)通過(guò)光度計(jì)檢測(cè)讀數(shù)，顏色的強(qiáng)度與樣品中DD含量成正比。免疫比濁法檢測(cè)DD的原理為：樣品中DD分子與包被有高特異性DD單克隆抗體的乳膠顆粒結(jié)合后，乳膠顆粒發(fā)生凝集，此時(shí)在405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)透射光強(qiáng)度變化，凝集程度與樣品中DD含量成正比。兩者均為免疫學(xué)方法，保證了較高的檢測(cè)特異度。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩種定量檢測(cè)方法均有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，尤其免疫比濁法通常由自動(dòng)化儀器完成檢測(cè)，具有更高的檢測(cè)靈敏度與精密度，避免了人工加樣的偶然誤差;而膠體金法對(duì)設(shè)備要求較低，且相對(duì)免疫比濁法有更寬的線性范圍。兩種方法對(duì)DIC均有*的診斷靈敏度，特異度稍低，適用于對(duì)DIC的聯(lián)合診斷及排查。比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法相關(guān)性不理想，因此不建議一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)使用這兩種方法報(bào)告DD檢測(cè)結(jié)果，選擇哪一種DD檢測(cè)方法需各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身具體情況決定。