薄膜過(guò)濾微生物測(cè)試法
一、培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備
1.配備與待測(cè)樣品數(shù)相同的無(wú)菌培養(yǎng)皿,另上一個(gè)作對(duì)照組(每種培養(yǎng)劑一個(gè)對(duì)照組),在每個(gè)培養(yǎng)皿上標(biāo)上待測(cè)樣品的記號(hào)
2.用燒過(guò)的鑷子將無(wú)菌吸收墊從包裝袋中取出,放入每個(gè)培養(yǎng)皿中,每取一個(gè)吸收墊,鑷子需用火燒一次
3.打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子到剛能加上約1.8m1的培養(yǎng)劑在吸收墊上,強(qiáng)烈建議使用裝有培養(yǎng)劑的小安瓿瓶、小瓶或小管,當(dāng)處理大量樣品時(shí),可使用無(wú)菌的吸管來(lái)分配培養(yǎng)劑
二、培養(yǎng)劑的種類:
總菌數(shù) 橙血清培養(yǎng)劑
酵母和霉菌數(shù) 橙血清培養(yǎng)劑
大腸桿菌數(shù) MF-Endo培養(yǎng)劑
糞便大腸桿菌數(shù) M-FC培養(yǎng)劑
4.應(yīng)有足夠的培養(yǎng)劑加入每個(gè)培養(yǎng)皿,使過(guò)濾膜能適當(dāng)?shù)卣掣街諌|。但過(guò)多的培養(yǎng)劑會(huì)引起菌落擴(kuò)展重疊,常常得不到正確的計(jì)數(shù)結(jié)果。有需要時(shí),建議調(diào)整推薦的培養(yǎng)劑數(shù),以便粘附和菌落生長(zhǎng)。
三、過(guò)濾器支架的準(zhǔn)備:
1.打開(kāi)預(yù)先滅菌的過(guò)濾器支架或?qū)⑦^(guò)濾器座、漏斗和漏斗蓋在沸水中浸沒(méi)一分鐘作消毒。若沒(méi)有沸水,用95%酒精噴灑于漏斗和漏斗蓋,然后將其點(diǎn)燃,在火熄滅以后,讓過(guò)濾器冷卻至40℃以下,如果必須使用酒精,漏斗必須用耐火材料制造。
2.用水煮過(guò)或火焰滅菌鉗子,將無(wú)菌過(guò)濾器的底座部分安裝于過(guò)濾燒瓶或真空管道上。
3.用火燒過(guò)的鑷子放一張無(wú)菌薄膜在過(guò)濾器底座上,根據(jù)測(cè)試目的,使用特定的過(guò)濾膜:
總菌數(shù)/大腸桿菌數(shù):0.45um薄膜
酵母菌和霉菌:0.80um薄膜
4.用水煮過(guò)或火焰滅菌鉗子,將過(guò)濾器漏斗和漏斗蓋放置于底座上。如漏斗蓋帶有管口,則在管口處裝上過(guò)濾器,或予以封住。待過(guò)濾器的溫度低于40℃后才可加樣品。
5.重復(fù)以上步驟,直到所有樣品都完成過(guò)濾。
四、樣品的過(guò)濾和平板培養(yǎng)
1.無(wú)菌地將樣品直接倒入消毒和冷卻的過(guò)濾器漏斗中。蓋上過(guò)濾器漏斗的蓋子。若使用勺須將勺放在95%的酒精的燒杯中。
2.施加真空,使樣品通過(guò)薄膜。無(wú)菌地打開(kāi)裝有無(wú)菌水的玻璃瓶,先用火燒螺紋處,然后倒入約20毫升無(wú)菌水于過(guò)濾漏斗內(nèi),進(jìn)行沖洗。施加真空,使無(wú)菌水通過(guò)薄膜。在過(guò)濾完樣品或無(wú)菌水后,不要讓真空施加時(shí)間連續(xù)超過(guò)30秒以上。
3.用火焰滅菌鉗子從過(guò)濾器底座上取下薄膜。輕微提起裝有吸收墊和培養(yǎng)劑的培養(yǎng)皿的蓋子,并放下薄膜,直到鑷子相對(duì)側(cè)的薄膜邊靠到吸收墊邊為止。將薄膜貼在吸收墊上滾動(dòng),以排除氣泡。蓋上蓋子,在工作臺(tái)上輕輕拍打培養(yǎng)皿,以驅(qū)除薄膜下面的氣泡。
4.作為對(duì)照組,用無(wú)菌水代替樣品重復(fù)上述過(guò)濾和平板培養(yǎng)程序。每一種培養(yǎng)劑須制備個(gè)空白培養(yǎng)皿。
五、樣品培養(yǎng)
1.為了防止在過(guò)濾膜表面形成冷凝水,所有培養(yǎng)皿必須倒置于培養(yǎng)箱中。
2.在培養(yǎng)箱中放置一燒杯水,以維持適當(dāng)?shù)臐穸取?/span>
3.在以下溫度下培養(yǎng)可以得到的結(jié)果:
總菌數(shù) 35℃
酵母菌和霉菌數(shù) 28℃
 
大腸桿菌數(shù) 35℃
注:只能使用一次性的培養(yǎng)皿,不能使用重復(fù)用的培養(yǎng)皿。
六、菌落數(shù)的計(jì)算
1.總菌數(shù) 
必須分別在培養(yǎng)24小時(shí)和72小時(shí)后計(jì)算菌數(shù)。點(diǎn)計(jì)所有菌落(不管類型),并記錄高數(shù)目
2.酵母菌和霉菌數(shù)
在培養(yǎng)48小時(shí)后,計(jì)點(diǎn)酵母菌和霉菌數(shù),并在此后每隔24小時(shí)再計(jì)點(diǎn)一次,直到過(guò)第五天,記錄高數(shù)目。
酵母菌通常為圓形的白色菌落。有時(shí)他們也帶有顏色。在一天至兩天后,一些酵母菌菌落的中心因吸收培養(yǎng)劑而變成藍(lán)色。
霉菌菌落會(huì)顯示不同顏色(包括白色、黃色、紅色、藍(lán)色和黑色),但從“絨毛狀”或“棉花狀”外觀很容易辨認(rèn)這種菌落。通常霉菌菌落比細(xì)菌或酵母菌的菌落為大。
細(xì)菌菌落通常比酵母菌更快吸收指示劑,而其顏色會(huì)變成藍(lán)色、綠色、藍(lán)綠色或褐色。再這種培養(yǎng)劑中,細(xì)菌菌落比一般酵母菌小。
3.大腸桿菌數(shù)
大腸桿菌菌落呈綠色或墨綠色,并有明顯的金屬光澤。在培養(yǎng)24小時(shí)后,只計(jì)算有“金屬光澤”的菌落。
一、培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備
1.配備與待測(cè)樣品數(shù)相同的無(wú)菌培養(yǎng)皿,另上一個(gè)作對(duì)照組(每種培養(yǎng)劑一個(gè)對(duì)照組),在每個(gè)培養(yǎng)皿上標(biāo)上待測(cè)樣品的記號(hào)
2.用燒過(guò)的鑷子將無(wú)菌吸收墊從包裝袋中取出,放入每個(gè)培養(yǎng)皿中,每取一個(gè)吸收墊,鑷子需用火燒一次
3.打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子到剛能加上約1.8m1的培養(yǎng)劑在吸收墊上,強(qiáng)烈建議使用裝有培養(yǎng)劑的小安瓿瓶、小瓶或小管,當(dāng)處理大量樣品時(shí),可使用無(wú)菌的吸管來(lái)分配培養(yǎng)劑
二、培養(yǎng)劑的種類:
總菌數(shù) 橙血清培養(yǎng)劑
酵母和霉菌數(shù) 橙血清培養(yǎng)劑
大腸桿菌數(shù) MF-Endo培養(yǎng)劑
糞便大腸桿菌數(shù) M-FC培養(yǎng)劑
4.應(yīng)有足夠的培養(yǎng)劑加入每個(gè)培養(yǎng)皿,使過(guò)濾膜能適當(dāng)?shù)卣掣街諌|。但過(guò)多的培養(yǎng)劑會(huì)引起菌落擴(kuò)展重疊,常常得不到正確的計(jì)數(shù)結(jié)果。有需要時(shí),建議調(diào)整推薦的培養(yǎng)劑數(shù),以便粘附和菌落生長(zhǎng)。
三、過(guò)濾器支架的準(zhǔn)備:
1.打開(kāi)預(yù)先滅菌的過(guò)濾器支架或?qū)⑦^(guò)濾器座、漏斗和漏斗蓋在沸水中浸沒(méi)一分鐘作消毒。若沒(méi)有沸水,用95%酒精噴灑于漏斗和漏斗蓋,然后將其點(diǎn)燃,在火熄滅以后,讓過(guò)濾器冷卻至40℃以下,如果必須使用酒精,漏斗必須用耐火材料制造。
2.用水煮過(guò)或火焰滅菌鉗子,將無(wú)菌過(guò)濾器的底座部分安裝于過(guò)濾燒瓶或真空管道上。
3.用火燒過(guò)的鑷子放一張無(wú)菌薄膜在過(guò)濾器底座上,根據(jù)測(cè)試目的,使用特定的過(guò)濾膜:
總菌數(shù)/大腸桿菌數(shù):0.45um薄膜
酵母菌和霉菌:0.80um薄膜
4.用水煮過(guò)或火焰滅菌鉗子,將過(guò)濾器漏斗和漏斗蓋放置于底座上。如漏斗蓋帶有管口,則在管口處裝上過(guò)濾器,或予以封住。待過(guò)濾器的溫度低于40℃后才可加樣品。
5.重復(fù)以上步驟,直到所有樣品都完成過(guò)濾。
四、樣品的過(guò)濾和平板培養(yǎng)
1.無(wú)菌地將樣品直接倒入消毒和冷卻的過(guò)濾器漏斗中。蓋上過(guò)濾器漏斗的蓋子。若使用勺須將勺放在95%的酒精的燒杯中。
2.施加真空,使樣品通過(guò)薄膜。無(wú)菌地打開(kāi)裝有無(wú)菌水的玻璃瓶,先用火燒螺紋處,然后倒入約20毫升無(wú)菌水于過(guò)濾漏斗內(nèi),進(jìn)行沖洗。施加真空,使無(wú)菌水通過(guò)薄膜。在過(guò)濾完樣品或無(wú)菌水后,不要讓真空施加時(shí)間連續(xù)超過(guò)30秒以上。
3.用火焰滅菌鉗子從過(guò)濾器底座上取下薄膜。輕微提起裝有吸收墊和培養(yǎng)劑的培養(yǎng)皿的蓋子,并放下薄膜,直到鑷子相對(duì)側(cè)的薄膜邊靠到吸收墊邊為止。將薄膜貼在吸收墊上滾動(dòng),以排除氣泡。蓋上蓋子,在工作臺(tái)上輕輕拍打培養(yǎng)皿,以驅(qū)除薄膜下面的氣泡。
4.作為對(duì)照組,用無(wú)菌水代替樣品重復(fù)上述過(guò)濾和平板培養(yǎng)程序。每一種培養(yǎng)劑須制備個(gè)空白培養(yǎng)皿。
五、樣品培養(yǎng)
1.為了防止在過(guò)濾膜表面形成冷凝水,所有培養(yǎng)皿必須倒置于培養(yǎng)箱中。
2.在培養(yǎng)箱中放置一燒杯水,以維持適當(dāng)?shù)臐穸取?/span>
3.在以下溫度下培養(yǎng)可以得到的結(jié)果:
總菌數(shù) 35℃
酵母菌和霉菌數(shù) 28℃
 
大腸桿菌數(shù) 35℃
注:只能使用一次性的培養(yǎng)皿,不能使用重復(fù)用的培養(yǎng)皿。
六、菌落數(shù)的計(jì)算
1.總菌數(shù) 
必須分別在培養(yǎng)24小時(shí)和72小時(shí)后計(jì)算菌數(shù)。點(diǎn)計(jì)所有菌落(不管類型),并記錄高數(shù)目
2.酵母菌和霉菌數(shù)
在培養(yǎng)48小時(shí)后,計(jì)點(diǎn)酵母菌和霉菌數(shù),并在此后每隔24小時(shí)再計(jì)點(diǎn)一次,直到過(guò)第五天,記錄高數(shù)目。
酵母菌通常為圓形的白色菌落。有時(shí)他們也帶有顏色。在一天至兩天后,一些酵母菌菌落的中心因吸收培養(yǎng)劑而變成藍(lán)色。
霉菌菌落會(huì)顯示不同顏色(包括白色、黃色、紅色、藍(lán)色和黑色),但從“絨毛狀”或“棉花狀”外觀很容易辨認(rèn)這種菌落。通常霉菌菌落比細(xì)菌或酵母菌的菌落為大。
細(xì)菌菌落通常比酵母菌更快吸收指示劑,而其顏色會(huì)變成藍(lán)色、綠色、藍(lán)綠色或褐色。再這種培養(yǎng)劑中,細(xì)菌菌落比一般酵母菌小。
3.大腸桿菌數(shù)
大腸桿菌菌落呈綠色或墨綠色,并有明顯的金屬光澤。在培養(yǎng)24小時(shí)后,只計(jì)算有“金屬光澤”的菌落。