實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time qPCR）是指在PCR反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強(qiáng)弱的變化，即時(shí)分析目的基因的初始量的一種PCR技術(shù)。

一、熒光化學(xué)物質(zhì)

Real-time qPCR所使用熒光化學(xué)物質(zhì)有熒光染料和熒光探針兩類。

1、熒光染料

目前主要使用的熒光染料是SYBR Green I，SYBR Green I是一種嵌入型花箐染料，在488nm（藍(lán)光）照射激發(fā)后，在522nm（綠光）具有發(fā)射高峰。

SYBR Green I是嵌在DNA螺旋的小溝里面的，一般用來染雙鏈DNA，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBR Green I的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。

2、熒光探針

Real-time qPCR中常用的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的FRET探針，該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收而不能發(fā)出熒光；PCR擴(kuò)增時(shí)，引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上，探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間；當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，PCR酶利用5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而使其發(fā)出熒光。

熒光信號被熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收，檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。

1）熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET

熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離臨近至一定范圍時(shí)（一般小于100?／10nm），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即以前一種熒光基團(tuán)的激發(fā)波長激發(fā)時(shí)，可觀察到后一個(gè)基團(tuán)發(fā)射的熒光。

簡單地說，就是在供體基團(tuán)吸收一定頻率的光子后第一電子發(fā)生能級躍遷被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移的過程。

此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的，供體分子被激發(fā)后，當(dāng)受體分子與供體分子相距一定距離，且供體和受體的基態(tài)及第一電子激發(fā)態(tài)兩者的振動能級間的能量差相互適應(yīng)時(shí)（同一振蕩頻率），處于激發(fā)態(tài)的供體將把一部分或全部能量轉(zhuǎn)移給受體，使受體被激發(fā)，在整個(gè)能量轉(zhuǎn)移過程中，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現(xiàn)出受體的熒光，并造成次級熒光光譜的紅移。

①FRET發(fā)生條件：

a.供體分子的發(fā)射光譜應(yīng)與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著重疊（＞30%）。

b.供體分子與受體分子的作用距離必須在1-10nm之間，基團(tuán)間的FRET效率可由E=1/［1+(R/R0)?］反映（R表示基團(tuán)分子之間的距離；R0表示E=50%時(shí)供體和受體分子間的距離，依賴熒光基團(tuán)發(fā)射譜和淬滅基團(tuán)激發(fā)譜的重疊程度以及基團(tuán)能量轉(zhuǎn)移的偶極子的相對方位，對于特定的供體受體對是常數(shù)）。

FRET程度與基團(tuán)之間的空間距離緊密相關(guān)，隨著距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱。

c.供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件。

b.檢測分子的折疊與構(gòu)像變化：

2）TaqMan探針

①設(shè)計(jì)原則：

a.長度：建議15-30bp，以保證結(jié)合特異性；擴(kuò)增子長度應(yīng)小于150 bp。

二、定量原理

理想的PCR反應(yīng)：X＝X?*2?；實(shí)際的PCR反應(yīng)：X＝X?*(1＋Ex)?（n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量，X?：初始模板量，Ex：擴(kuò)增效率）；在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí)：XCt＝X?*(1＋Ex)??＝S （XCt：熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值線設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，設(shè)為S）；方程式兩邊同時(shí)取對數(shù)得: lgS＝lg［X?*(1＋Ex)??］，整理方程式得: lgX?＝-lg(1＋Ex) ??＋lgS。

結(jié)論：

①模板DNA量越多，達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

②lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系。

a. 根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）即可計(jì)算出樣品中所含的模板量。(相對定量)

b. 通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，即可計(jì)算出樣品中所含的模板量。（絕對定量）

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