小鼠胚胎成纖維細胞分離、培養(yǎng)及鑒定教程

一：細胞簡介

小鼠胚胎成年維細胞常用作ES細胞培養(yǎng)常用的飼養(yǎng)層細胞，能產(chǎn)生抑制ES細胞自主分化和促進ES細胞增殖的因子，故能有效地促進ES細胞的增殖井維持其示分化特性和多潛能性，

且分泌效果優(yōu)于外源添加的一些因子而且可以為ES細胞的培養(yǎng)提供類似于體內(nèi)的微環(huán)境故在研究哺彩L動物ES細胞中得到廣泛使用。

二：實驗準備

提前準備好將要用到的工具、試劑：無菌槍頭、無菌EP管、小鼠胚胎成纖維細胞專用培養(yǎng)基、胚胎成纖維細胞組織分離液、胚胎成纖維細胞

基礎培養(yǎng)基、HBSS緩沖液。

三：實驗步驟

取孕13.5天小鼠,斷頸處死，置于體積分數(shù)為75%酒精消毒3 min無菌打開孕鼠腹腔可見腹腔兩側呈“V”字型串珠樣子宮。用鑷子提起子宮（

注意:不能碰到皮毛，以防污雜）并用眼科剪去除子宮系膜和結締組織，將子宮放入含有HBSS的一次性無菌培養(yǎng)皿中漂洗兩三遍去除淤血，

用眼科剪和鑷子去除胎盤、手膜等胚胎外組織，取出胚胎放入另一平皿用HBSS洗滌，直到?jīng)]有血跡為止。用眼科剪和鑷子去除胚胎的頭部、

四肢及內(nèi)臟，留取軀干部（頭部、四肢及內(nèi)臟需去除干凈）將軀干部放入玻璃平皿中用HBSS洗滌1次，用眼科剪將胚胎軀干部剪碎成糊狀加入

5mL HBSS混勿移入離心管中，自然沉降3min后將上清液輕輕吸出棄掉加入3mL 組織分離液輕輕吹打后室溫下自然沉降2min，

將上清液輕輕吸出棄掉加入3mL 組織分離液輕輕吹打后室溫下消化3min，將上部的單細胞懸液輕輕吸出放入另一個離心管中加等量小鼠胚胎

成纖維細胞專用培養(yǎng)基終止消化，重復消化兩次若還有未消化的組織再加入2 mL組織分離液輕輕吹打至消化。終止消化，

混勻離心管收集所有細胞懸液自然沉降1min，將大塊沉淀吸出棄掉800轉每分鐘離心5mi棄去上清，

使用小鼠胚胎成纖維細胞專用培養(yǎng)基重懸至5 mL吸取細胞溶液，加入臺盼藍進行計數(shù)按5x106/瓶接種到T25培養(yǎng)瓶中補足體積分數(shù)為小鼠

胚胎成纖維細胞專用培養(yǎng)基記為原代（PO）搖晃混勻，在37℃、體積分數(shù)為5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液。

細胞鑒定

24h后可見絕大部分貼壁細胞呈成纖維細胞樣，細胞體積較小，雜細胞較少，30min細胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起，6h后細胞基本貼壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團；分布較均勻，散在生長，不聚集成團，細胞生長迅速，

5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細胞質透明，細胞核較大，呈橢圓形，顏色淡，細胞融合，

并彼此連接成網(wǎng)狀，細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布，細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分

布，小鼠胚胎成纖維細胞經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定純度可達90%以上