一、組氨酸的差向異構(gòu)化

對(duì)映體純度極大地影響肽的生物活性；因此，避免D-異構(gòu)體含量的增加至關(guān)重要。¹在固相肽合成（SPPS）的偶聯(lián)過程激活階段，組氨酸特別容易發(fā)生差向異構(gòu)化。組氨酸傾向于差向異構(gòu)化（圖1）是一種分子內(nèi)的副反應(yīng)，這是由于咪唑N^π上的孤對(duì)電子與酸性α碳?xì)涞慕咏运鶎?dǎo)致。當(dāng)氨基酸被激活時(shí)，1號(hào)位的孤對(duì)電子具有足夠的堿性以進(jìn)行去質(zhì)子化，從而形成一個(gè)無(wú)立體選擇性的酯烯醇鹽2²。

此時(shí)，轉(zhuǎn)化為L-或D-異構(gòu)體3并沒有熱力學(xué)上的優(yōu)先途徑。當(dāng)反應(yīng)位點(diǎn)聚集，且組氨酸在激活狀態(tài)保持較長(zhǎng)時(shí)間的期間，差向異構(gòu)化的可能性增加。

二、組氨酸側(cè)鏈保護(hù)

對(duì)咪唑環(huán)的保護(hù)（圖2）通常采用在N^τ位置使用三苯甲基（Trt）基團(tuán)的方式實(shí)現(xiàn)⁴。Trt基團(tuán)因其體積大和具有吸電子性，能夠有效抑制諸如環(huán)上N-?；雀狈磻?yīng)，然而在控制差向異構(gòu)化方面效果有限。其他側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，尤其是那些提供N^π保護(hù)的，例如Fmoc-His(π-Mbom)-OH（5），通過阻斷α-氫的接觸途徑來減少差向異構(gòu)化。但這些衍生物的缺點(diǎn)在于它們本身的高成本和因多步驟合成策略導(dǎo)致的低批量供應(yīng)，這種策略需要在連接Mbom基團(tuán)時(shí)對(duì)N^α位置進(jìn)行互斥保護(hù)。^3,4,5,6此外，在肽切割過程中還需添加額外的清除劑，以防止新暴露的氨基功能團(tuán)上發(fā)生羥甲基化。

本文中，Fmoc-His(Boc)-OH（6）被證實(shí)是Fmoc SPPS中組氨酸并入的寶貴替代物，因?yàn)樗诟邷叵聦?duì)差向異構(gòu)化具有較高的穩(wěn)定性，成本低，且比其他任何市場(chǎng)上可購(gòu)買的衍生物具有更好的批量供應(yīng)能力。

三、Fmoc-His(Boc)-OH的優(yōu)勢(shì)

Fmoc-His(Boc)-OH 能夠以游離酸和環(huán)己胺（CHA）鹽的形式大量購(gòu)買。對(duì)于鹽形式，需要通過提取過程來移除CHA基團(tuán)。鑒于這一過程相對(duì)繁瑣，我們的研究便專注于游離酸的應(yīng)用。根據(jù)先前的報(bào)告，與His(Trt) 相比，His(Boc)在差向異構(gòu)化方面的傾向性更低。⁷這一現(xiàn)象可以歸因于氨基甲酸酯基團(tuán)較強(qiáng)的吸電子效應(yīng)，它有效地從π子中抽取電子云密度，從而降低了其堿性。

四、討論

一項(xiàng)采用利拉魯肽和^1-42Beta淀粉樣蛋白的可行性研究評(píng)估了-Boc基團(tuán)在微波（MW）輔助固相肽合成（SPPS）過程中對(duì)差向異構(gòu)化的抑制效果及側(cè)鏈的穩(wěn)定性。肽段是在HE-SPPS條件下制備的，具體操作包括1分鐘90°C的去保護(hù)和2分鐘90°C使用DIC和Oxyma Pure進(jìn)行的偶聯(lián)。⁸與基于尿嘧啶的激活策略相比，DIC/Oxyma Pure激活在偶聯(lián)效率和抑制差向異構(gòu)化方面提供了更優(yōu)的結(jié)果。后者的表現(xiàn)歸因于碳二亞胺活化所固有的酸性環(huán)境。^9,10在室溫或稍高的條件（例如50°C）下并入組氨酸能進(jìn)一步降低D-異構(gòu)體的形成，但這樣的條件對(duì)于His(Trt)仍然不夠理想。我們比較了His(Trt)和His(Boc)在使用兩種常見協(xié)議時(shí)的偶聯(lián)條件：（1）10分鐘50°C和（2）2分鐘90°C。最后，我們研究了溶液中的穩(wěn)定性，以確定其在Liberty Blue^TM HT12上的高通量自動(dòng)化應(yīng)用的可行性。

利拉魯肽的合成

利拉魯肽具有一個(gè)N端的組氨酸，這在與肽鏈的偶聯(lián)中存在一定難度，因此，通過微波加熱來增強(qiáng)?；饔檬怯幸娴?。使用三苯甲基保護(hù)在50°C下偶聯(lián)組氨酸10分鐘，結(jié)果顯示D-異構(gòu)體的形成增加到了6.8%（如表1所示）。在相同條件下，Fmoc-His(Boc)-OH顯著減少了差向異構(gòu)化，僅為0.18%。

Fmoc-His(Boc)-OH在90°C時(shí)的表現(xiàn)也相當(dāng)出色，觀察到的差向異構(gòu)化水平為0.81%，相比之下His(Trt)則大于16%。Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Boc)-OH都以相當(dāng)?shù)拇旨兌全@得了目標(biāo)肽（圖3）。Fmoc-His(π-Mbom)-OH在純度和D-His方面提供了與Fmoc-His(Boc)-OH相似的結(jié)果。

表1：利拉魯肽中組氨酸在不同偶聯(lián)條件下的D-異構(gòu)體形成情況

1-42Beta淀粉樣的合成

之前的研究表明，在長(zhǎng)時(shí)間的哌啶處理過程中，N^τ-Boc側(cè)鏈基團(tuán)顯示出不穩(wěn)定性。¹¹為了測(cè)試高溫去保護(hù)過程中–Boc的穩(wěn)定性，我們合成了包含三個(gè)組氨酸殘基的^1-42Beta淀粉樣蛋白。^1-42Beta淀粉樣蛋白的合成序列是出了名的困難，需要使用特殊的偶聯(lián)試劑，即使在嚴(yán)苛條件下，產(chǎn)物純度通常也過低，無(wú)法進(jìn)行分析和純化。¹²與常規(guī)合成方法不同，HE-SPPS即便在未優(yōu)化的條件下也能獲得木及高的粗純度。我們比較了His(Trt)和His(Boc)在50°C下偶聯(lián)10分鐘以及90°C下偶聯(lián)2分鐘的情況。His(Boc)將總合成時(shí)間從4小時(shí)24分鐘縮短到3小時(shí)58分鐘，并且將差向異構(gòu)化的比例從2.88%降低至1.29% D-異構(gòu)體（表2）。UPLC分析表明，這兩種合成方法得到的目標(biāo)產(chǎn)物在粗純度上具有可比性（圖4）。

表2：BA中His(Trt)和His(Boc)的差向異構(gòu)化情況

圖4：使用(a) His(Trt)和(b) His(Boc)的1-42 Beta淀粉樣蛋白的UPLC色譜圖

溶液中的穩(wěn)定性

在自動(dòng)化高通量SPPS應(yīng)用中，要求底物能在溶液中保持溶解狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)10天。通常，像組氨酸這樣的反應(yīng)物由于保護(hù)基團(tuán)的降解/丟失而導(dǎo)致變色和沉淀，其溶液壽命僅限于5天。在這項(xiàng)研究中，我們測(cè)試了組氨酸溶液（DMF，0.2 M）在大氣條件下存放10天的穩(wěn)定性（圖5）。所有樣品都迅速溶解，得到無(wú)色溶液。Fmoc-His(Trt)-OH的變色在短短24小時(shí)內(nèi)就開始出現(xiàn)，并在10天的時(shí)間里加劇。10天后，Fmoc-His(π-Mbom)-OH溶液略呈黃色，而Fmoc-His(Boc)-OH溶液在研究期間保持無(wú)色。UPLC分析表明，Fmoc-His(Boc)-OH和Fmoc-His(π-Mbom)-OH保持了>99%的純度。基于強(qiáng)烈的變色，預(yù)計(jì)在10天的研究期間Fmoc-His(Trt)-OH樣品中形成了幾種雜質(zhì)（圖6）。然而，使用質(zhì)譜對(duì)這些雜質(zhì)進(jìn)行定性未能成功。

圖6. 10天后DMF中組氨酸衍生物(0.2 M)的UPLC分析；(a) = Fmoc-His(Trt)-OH (b) = Fmoc-His(π-Mbom)-OH (c) = Fmoc-His(Boc)-OH

五、結(jié)論

上述數(shù)據(jù)表明，His(Boc)是一種強(qiáng)大的組氨酸衍生物，可以在90°C下高效偶聯(lián)，提供優(yōu)良的粗純度，同時(shí)縮短偶聯(lián)時(shí)間并顯著降低差向異構(gòu)化。與其他抑制差向異構(gòu)化的N保護(hù)衍生物相比，F(xiàn)moc-His(Boc)-OH更易獲得，同時(shí)保持相當(dāng)?shù)暮铣尚阅堋?/span>總之，Fmoc-His(Boc)-OH的核心優(yōu)勢(shì)包括：

• 商業(yè)批量可用性強(qiáng)，價(jià)格相對(duì)于Fmoc-His(Trt)-OH更具競(jìng)爭(zhēng)力

• 在高溫下具有低水平的差向異構(gòu)化；50°C及以下的偶聯(lián)溫度使得Fmoc-His(Boc)-OH適用于活性藥物成分的合成，無(wú)需復(fù)雜的偶聯(lián)試劑和條件¹³

• 優(yōu)異的溶液穩(wěn)定性；與Fmoc-His(π-Mbom)-OH相當(dāng)，且優(yōu)于Fmoc-His(Trt)-OH

六、材料與方法

試劑

以下Fmoc氨基酸和樹脂購(gòu)自位于Matthews，NC的CEM公司，包含所示的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)：Ala, Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Gln(Trt), Gly, His(Boc), His(Trt), Ile, Leu, Lys(Boc), Lys(palmitoyl-Glu-OtBu), Phe, Pro, Ser(tBu), Tyr(tBu), Val。Rink Amide ProTideTM LL, Cl-MPA ProTideTM LL, 以及Fmoc-Gly Wang PS LL樹脂也購(gòu)自CEM公司。二異丙基碳二亞胺（DIC），哌啶，三氟乙酉夋（TFA），3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT）和三異丙基硅烷（TIS）購(gòu)自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）。二氯甲烷（DCM），N,N-二甲基甲酰胺（DMF），無(wú)水二乙酉迷（Et₂O），乙酸，高效液相色譜級(jí)水，以及乙腈購(gòu)自VWR（West Chester, PA）。液相色譜-質(zhì)譜級(jí)水（H₂O）和液相色譜-質(zhì)譜級(jí)乙腈（MeCN）購(gòu)自Fisher Scientific（Waltham, MA）。D-異構(gòu)體通過手性GC-MS（C.A.T. GmbH）進(jìn)行測(cè)定。

肽合成：利拉魯肽

在CEM Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成器上，以0.10 mmol的規(guī)模合成了該肽。使用了0.313克Fmoc Gly Wang PS LL樹脂（0.32 meq/g置換）。去保護(hù)作用采用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中執(zhí)行。偶聯(lián)反應(yīng)使用5倍過量的0.2 M Fmoc-AA、1.0 M DIC和1.0 M Oxyma Pure在DMF（CarboMAX）中進(jìn)行。切割則應(yīng)用CEM Razor™高通量肽切割系統(tǒng)，配比為92.5:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，肽通過Et₂O沉淀并過夜凍干。

肽合成：1-42Beta淀粉樣蛋白

采用CEM Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成器，以0.10 mmol的規(guī)模在0.512g Cl-MPA ProTide樹脂（0.19 meq/g置換）上合成了該肽。去保護(hù)作用使用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)用5倍過量的0.2 M Fmoc-AA、1.0 M DIC和1.0 M Oxyma Pure在DMF（CarboMAX）中進(jìn)行。切割采用CEM Razor™高通量肽切割系統(tǒng)，配比為92.5:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，肽通過Et₂O沉淀并過夜凍干。

穩(wěn)定性研究

在50毫升離心管中，制備了0.2摩爾濃度的組氨酸溶液（總共5毫升DMF），并對(duì)管進(jìn)行了密封。這些溶液在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下保持在室溫，持續(xù)10天。為了準(zhǔn)備用于超高效液相色譜-質(zhì)譜分析的樣品，將10微升的組氨酸溶液稀釋到5毫升的50/50（體積比）乙腈和水的混合溶劑中。調(diào)整進(jìn)樣量，直至吸光度達(dá)到35 – 55單位。

七、參考文獻(xiàn)

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