在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）因其在調(diào)控細(xì)胞過(guò)程中的復(fù)雜作用而備受關(guān)注，特別是它們?cè)谡{(diào)控細(xì)胞分裂等關(guān)鍵生物過(guò)程中所扮演的角色。這些分子不僅參與調(diào)控細(xì)胞分裂的精細(xì)過(guò)程，還與基因組穩(wěn)定性密切相關(guān)。但lncRNAs的具體功能和作用機(jī)制，仍是科研領(lǐng)域的未解之謎。

最近，一項(xiàng)發(fā)表在《Nature Communications》上的研究，利用高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù)結(jié)合siRNA文庫(kù)篩選方案，為我們揭示了lncRNA在細(xì)胞分裂中的重要作用。接下來(lái)就跟小編儀器深入探究這項(xiàng)研究是如何巧妙地利用高內(nèi)涵細(xì)胞成像篩選技術(shù)結(jié)合siRNA文庫(kù)策略，成功挖掘出一篇影響因子高達(dá)12+的學(xué)術(shù)文章的奧秘吧！

研究背景

細(xì)胞分裂是生物體生長(zhǎng)和維持組織功能的基礎(chǔ)。在這一過(guò)程中，染色體的準(zhǔn)確分配至子細(xì)胞是至關(guān)重要的。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在細(xì)胞周期、分化、增殖和凋亡等多種細(xì)胞過(guò)程中扮演著調(diào)控者的角色。然而，大多數(shù)lncRNA的生物學(xué)功能仍然是一個(gè)謎。

研究方法

該研究由英國(guó)倫敦大學(xué)瑪麗皇后學(xué)院Lovorka Stojic研究組聯(lián)合劍橋大學(xué)Fanni Gergely及Duncan T. Odom研究組，通過(guò)靶向2000多個(gè)人類(lèi)lncRNAs的高內(nèi)涵RNAi成像篩選，鑒定了許多參與細(xì)胞分裂關(guān)鍵步驟的lncRNAs，如染色體分離、有絲分裂持續(xù)時(shí)間和胞質(zhì)分裂。并揭示了與基因組穩(wěn)定性有關(guān)的幾種lncRNAs，以及控制微管行為并具有細(xì)胞分裂以外功能的lncRNA。

研究思路

01

siRNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染，利用高內(nèi)涵篩選表型,發(fā)現(xiàn)LncRNA在細(xì)胞分裂不同階段具有功能，例如有絲分裂，染色體分離，胞質(zhì)分裂；

為了鑒定參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的lncRNAs，研究人員進(jìn)行了兩次連續(xù)的RNAi篩選（篩選A和B），即將靶向2231個(gè)人類(lèi)lncRNAs的siRNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，并使用高內(nèi)涵篩選有絲分裂表型以檢查其效果。

02

確定相關(guān)LncRNA,對(duì)相關(guān)LncRNA的作用做進(jìn)一步確認(rèn),使用不同表征方法；

03

利用RNA-Seq,對(duì)比RNAi和LNA介導(dǎo)LncRNA的功能缺失細(xì)胞中,基因轉(zhuǎn)錄差異。鑒定出linc00899相關(guān)的TPPP蛋白高表達(dá)。對(duì)TPPP高表達(dá)是否影響有絲分裂時(shí)間進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)linc00899和TPPP之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證；

04

TPPP作用于微管,所以研究linc00899對(duì)紡錘體中微管動(dòng)態(tài)變化的控制。主要通過(guò)表型進(jìn)行對(duì)比；

05

linc00899和TPPP之間的調(diào)控在不同細(xì)胞系的有絲分裂過(guò)程中均存在。linc00899和TPPP之間的調(diào)控分類(lèi),屬于trans,只有在內(nèi)源linc00899過(guò)表達(dá)時(shí)才能抑制TPPP的表達(dá)

主要發(fā)現(xiàn)

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研究發(fā)現(xiàn)linc00899這一染色質(zhì)相關(guān)的lncRNA，在多種細(xì)胞類(lèi)型中，其耗竭會(huì)導(dǎo)致明顯的有絲分裂延遲。

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通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析linc00899耗竭的細(xì)胞，研究團(tuán)隊(duì)鑒定出神經(jīng)元微管結(jié)合蛋白TPPP/p25作為linc00899的靶標(biāo)。

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linc00899與TPPP/p25結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，當(dāng)linc00899耗竭時(shí)，TPPP/p25的上調(diào)改變了微管動(dòng)力學(xué)并延遲了有絲分裂。

研究意義

這項(xiàng)研究不僅展示了lncRNA在維持基因組穩(wěn)定性中的多重角色，而且還揭示了linc00899通過(guò)控制微管行為來(lái)調(diào)控有絲分裂的新穎機(jī)制。這對(duì)于我們理解lncRNA在細(xì)胞周期進(jìn)程中的功能以及它們?cè)谌祟?lèi)疾病，特別是癌癥中的作用具有重要意義。

技術(shù)亮點(diǎn)

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本文中利用了瑞孚迪（Revvity）的Opera高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù)結(jié)合siRNA文庫(kù)篩選方案，為研究lncRNA在復(fù)雜生物過(guò)程中的作用提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具。

傳統(tǒng)的RNAi篩選技術(shù)通常只能針對(duì)單個(gè)或少量基因進(jìn)行分析，而高內(nèi)涵RNAi篩選技術(shù)則能夠在單一實(shí)驗(yàn)中同時(shí)分析數(shù)千個(gè)lncRNAs的功能。利用這一技術(shù)，可對(duì)大量lncRNAs在細(xì)胞分裂過(guò)程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)性篩選，并通過(guò)圖像分析算法對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和分裂情況進(jìn)行定量分析。這些數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，利用統(tǒng)計(jì)方法可快速篩選出對(duì)細(xì)胞分裂具有顯著影響的lncRNAs。

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瑞孚迪的Opera平臺(tái)可提供高分辨率的細(xì)胞成像，捕捉細(xì)胞分裂過(guò)程中的細(xì)微變化。搭配Columbus軟件可進(jìn)行自動(dòng)化圖像分析流程，快速處理大量數(shù)據(jù)，識(shí)別關(guān)鍵細(xì)胞表型變化。

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這篇研究使用的The Lincode siRNA Library由Dharmacon提供，Dharmacon siRNA產(chǎn)品有如下特點(diǎn)：

SMARTselectionTM技術(shù)——高度特異性，確保沉默效率

SMARTpoolTM技術(shù)——無(wú)需驗(yàn)證，保證至少75％靶基因沉默效率

雙鏈修飾技術(shù)，有效減少off-target并進(jìn)一步提升沉默效率

在功能基因組學(xué)的研究中，瑞孚迪可提供了一系列的解決方案，包括高內(nèi)涵成像篩選系統(tǒng)、基因編輯技術(shù)、siRNA文庫(kù)、高通量篩選平臺(tái)等，這些工具和技術(shù)服務(wù)幫助科研人員更深入地理解基因的功能和基因間的相互作用，加速了從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。