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GB4789.3-2016 大腸菌群計(jì)數(shù)及注意事項(xiàng)
01
大腸菌群定義和衛(wèi)生學(xué)意義
大腸菌群定義：
在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名，它不代表某一種或某一屬的細(xì)菌，而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這群細(xì)菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬（又叫產(chǎn)氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）和等。
衛(wèi)生學(xué)意義：
大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評(píng)價(jià)樣品中是否受到糞便的污染。表示了對(duì)人體健康是否具有潛在的危險(xiǎn)性。直接反映了樣品受糞便污染的程度。
02
GB4789.3-2016 大腸菌群MPN法
1
什么是MPN法?
MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測(cè)法。待測(cè)樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后，根據(jù)其未生長(zhǎng)的zui低稀釋度與生長(zhǎng)的最高稀釋度，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測(cè)樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。
MPN值并不能表示實(shí)際菌落數(shù)，實(shí)際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn)，MPN值是落在這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點(diǎn)。
靈敏度較高，適用于污染菌落較少的樣品。
2
大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)操作
操 作 注 意 事 項(xiàng)
1
建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，因?yàn)榱姿猁}緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化，對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用。
2
初發(fā)酵接種量超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯。
3
培養(yǎng)基檢查。加入樣品前應(yīng)觀察導(dǎo)管內(nèi)是否有氣泡，若有，應(yīng)適當(dāng)傾斜試管，讓氣體排出。
4
結(jié)果觀察。某些食品樣品可能會(huì)堵塞小導(dǎo)管底部，影響導(dǎo)管內(nèi)氣泡的觀察，可將試管微微傾斜，用手指輕彈管壁，觀察是否有一串小氣泡沿管壁升起，若有，則判定產(chǎn)氣。
3
培養(yǎng)基原理解析
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)：
? 月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。
? 36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣，則可停止培養(yǎng)。如果沒(méi)有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象，則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。
? 如接種量超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯。
煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)：
? 膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)。
? 培養(yǎng)基配方當(dāng)中含有膽鹽，大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會(huì)與膽鹽發(fā)生反應(yīng)，形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來(lái)的綠色變?yōu)辄S色。
4
大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)報(bào)告
確證的大腸菌群BGLB陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN表，報(bào)告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值
當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MPN表中無(wú)法查找到MPN值時(shí)，如：陽(yáng)性管數(shù)為122，123，232，233等時(shí)，建議增加稀釋度(可做4~5個(gè)稀釋度)，使樣品最高稀釋度能達(dá)到陰性終點(diǎn)(如果污染程度不能判定，則多加一稀釋度)，然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找，最終確定MPN值。
表B.1
大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表
03
GB4789.3-2016大腸菌群計(jì)數(shù)平板法
1
大腸菌群平板計(jì)數(shù)法流程圖
操 作 注 意 事 項(xiàng)
1
平板法相對(duì)MPN法來(lái)說(shuō)，結(jié)果更加直觀精確。長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來(lái)自樣品中的2~3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。適用于污染較為嚴(yán)重的樣品。
2
從一個(gè)樣品取樣到傾注瓊脂平板，應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成。
3
檢驗(yàn)所用物品應(yīng)無(wú)菌，無(wú)抑菌殘留物。
4
BGLB確證試驗(yàn)需從VRBA平板上挑起至少10個(gè)典型和可疑菌落進(jìn)行，如平板上菌落數(shù)少于10個(gè)，則挑取全部典型和可疑菌落進(jìn)行確證。
2
培養(yǎng)基原理解析
結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)：
? 配方中膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色。
? 大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結(jié)合，可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。
? 該培養(yǎng)基無(wú)需高溫高壓滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。
3
計(jì)數(shù)典型和可疑菌落數(shù)
大腸菌群定義：
選取菌落數(shù)在15CFU~150 CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。
證實(shí)試驗(yàn)：
從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。
4
大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告
經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：
100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。
若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
04
質(zhì)量控制
實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中，每批樣品稀釋液都要做空白對(duì)照。
為了控制環(huán)境污染，每次檢驗(yàn)過(guò)程中，于檢驗(yàn)臺(tái)上打開兩塊計(jì)數(shù)瓊脂平板，并在檢驗(yàn)環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，以掌握檢驗(yàn)過(guò)程中是否存在來(lái)自檢驗(yàn)環(huán)境的污染。
定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應(yīng)定量活菌參考品，在P2實(shí)驗(yàn)室或陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并進(jìn)行記錄，次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)至少每2個(gè)月進(jìn)行1次。
05
大腸菌群測(cè)試片法
1
原理
大腸菌群檢測(cè)片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐，其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑)和透明隔水膜組成，經(jīng)輻照滅菌。可用于食品、飲料等的大腸菌群計(jì)數(shù)。含有四氮唑指示劑菌落為紅色，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。
2
培養(yǎng)基原理解析
菌落計(jì)數(shù)特別方便(容易判讀)，紅色菌落，易于食品顆粒分開，無(wú)菌落重疊現(xiàn)象；
菌落分布特別均勻；
避免了培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌熱損傷有關(guān)；
菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生；
經(jīng)濟(jì)環(huán)保無(wú)粉塵，體積小，重量輕，易儲(chǔ)運(yùn)；
保質(zhì)期長(zhǎng)干制無(wú)水培養(yǎng)基，性質(zhì)穩(wěn)定，保質(zhì)期更長(zhǎng)。
3
使用說(shuō)明
06
所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株
專注微生物監(jiān)測(cè)控制，為食藥安全保駕護(hù)航
微生物監(jiān)測(cè)控制整體解決方案的提供者
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