新開發(fā)的療法，如干細胞療法，正在將醫(yī)學領域從治療癥狀轉變?yōu)橹斡膊?。人類誘導多能干細胞(iPSCs)以其分化為不同細胞類型和組織的能力改變了再生醫(yī)學。雖然人類iPSCs已經用于自體治療，但下一個突破將是開發(fā)經認證的iPSCs用于現成的治療。為了實現這一目標，可以通過人類白細胞抗原(HLA)消耗來降低異種iPSCs的免疫原性，從而建立GMP級的主細胞庫，用于細胞的大規(guī)模生產，同時降低同種異體療法的制造成本^[1]。

開發(fā)基因工程的iPSCs需要在轉染后進行幾輪克隆篩選，傳統(tǒng)的有限稀釋法分離單細胞耗時長，熒光標記分選影響高度敏感的iPSCs的存活率，并且有污染的風險。相比之下，CYTENA的克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)利用透明微流控芯片和實時成像技術、算法，以高活力和高效率將單細胞分選和分配到96/384孔板內。

近年來，利用此設備分離iPSCs的方法已被報道^[2-4]。在這里，展示了使用UP.SIGHT在不損失多能性的情況下，對人類iPSCs溫和分離單細胞克隆在技術上是可行的，在方法優(yōu)化后的單克隆回收率高達80%。

材料與方法

來源于人成纖維細胞的對照iPSCs在無滋養(yǎng)層細胞的6孔板中，用TeSR E8培養(yǎng)基培養(yǎng)^[5]。細胞匯合度到70%的時候，按1:3 ~ 1:6比例稀釋傳代。用于單細胞分選的細胞也在60- 70%的匯合度下進行收獲，確保細胞看起來健康且未分化的狀態(tài),并以0.5-0.8x10 ⁶個細胞/ mL的濃度在基礎培養(yǎng)基中重懸為單細胞懸液。將80 uL的單細胞懸液裝入芯片（EASY.ON cartridge）并安裝在UP.SIGHT上進行單細胞分選。單細胞重懸液和孔板中的克隆培養(yǎng)基中都含有ROCK抑制劑，單細胞分選于裝有克隆培養(yǎng)基的96孔板上，分選完的板子盡快轉回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在前7天用UP.SIGHT監(jiān)測iPSCs的單克隆生長。

結果與討論

對照組采用手動有限制稀釋法，濃度為0.5個細胞/孔進行鋪板 ^[6-7]，10天后達到了預期的10-20%的克隆率(數據未顯示)。使用UP.SIGHT進行的第一次分選實驗在相同的條件下獲得了6%的克隆率(圖1 A)。以這些實驗設計為基準，通過系統(tǒng)的逐步優(yōu)化條件來逐漸提高回收率。

首先，我們優(yōu)化了裝載在UP.SIGHT墨盒上的細胞重懸液。確定與使用原始基礎培養(yǎng)基相比，使用鹽水緩沖液后近乎使克隆恢復提高一倍(圖1 B)。其次，由于iPSCs通常需要定期更換培養(yǎng)基，這種在早期更換培養(yǎng)基的操作對脆弱敏感的iPSCs的生長是有不利的，我們測試了在分選后的前7天中通過添加補充制劑到培養(yǎng)基中來避免更換培養(yǎng)基組份的效果。用補充制劑A(圖1 C)和不同濃度的補充制劑B(圖1 D和E)添加到克隆培養(yǎng)基，均可以獲得更高的單克隆率，其中補充制劑B可提高到50%。

圖1：優(yōu)化分選提高克隆回收率

A:初始重懸細胞液條件，與標準培養(yǎng)條件最相似。B:鹽溶液作為重懸液。C:添加了補充制劑A的克隆培養(yǎng)基. D-E:添了不同濃度補充制劑B的克隆培養(yǎng)基. F:克隆培養(yǎng)基改為添加了補充制劑B的單細胞克隆培養(yǎng)基?？寺』謴椭狄缘?-10天克隆生長孔的百分比表示。

添加劑能夠保持分選后的培養(yǎng)板細胞在前7天不受干擾，顯著提高了克隆率。在7天后，我們獲得了更大尺寸和良好形態(tài)的克隆團(圖2)。最后，我們替換了克隆板中的標準培養(yǎng)基，并使用優(yōu)化的培養(yǎng)基進行iPSCs的單細胞接種，優(yōu)化條件包括鹽溶液重懸樣品，加上適合目的的克隆培養(yǎng)基，并以優(yōu)化濃度的培養(yǎng)基補充物等，從而獲得高達80%的單克隆率(圖1 F)和長勢良好的克隆團(圖2)。

（值得一提的是：此次實驗還測試了其他沒有顯著影響克隆恢復的參數。如，不同的ROCK抑制劑配方、板涂層和板類型。但不能認為這些變量在其他實驗條件下使用時不會對克隆恢復產生影響。）

圖2：克隆生長與形態(tài)

使用UP.SIGHT分選單細胞到96孔板中，并在第7天進行板底成像。

本實驗中對UP.SIGHT板成像能力也進行了測試。從圖中能夠確認圖像質量足夠好，可以評估克隆的形態(tài)，以確定細胞在單細胞分選后是否保持其典型的iPSCs形態(tài)(圖2)。

圖3：用UP.SIGHT進行克隆生長監(jiān)測

此外，UP.SIGHT上的成像系統(tǒng)與傳統(tǒng)顯微鏡相比具有更快的優(yōu)勢:整個孔板(96/384孔板)的圖像采集不到6分鐘，大大減少了孔板在培養(yǎng)箱外的停留時間，尤其是384孔板。當在全孔板上進行初始篩選時，這一點特別重要，可以在多個時間點快速進行成像(圖3)。

結論

本研究表明，使用UP.SIGHT分選iPSCs可獲得良好形態(tài)的克隆團，具有較高的克隆恢復率。為了克隆恢復，可通過優(yōu)化關鍵參數：細胞在分選前收獲時的活率和生長狀態(tài)、細胞懸液、克隆培養(yǎng)基及補充物，以確保細胞在分選后的第一天盡可能不受干擾；UP.SIGHT的快速平板成像功能可實現生長克隆的形態(tài)監(jiān)控和快速篩選。

總之，UP.SIGHT是一種多用途儀器，可實現高效、高質量和節(jié)省時間的iPSCs分選和早期監(jiān)測，以選擇正確優(yōu)質的單克隆。

參考文獻[1]   Jarrige, M., Frank, E., Herardot, E., et al. (2021). The future of regenerative medicine: Cell therapy using pluripotent stem cells and acellular therapies based on extracellular vesicles. Cells 10, 1–29. 10.3390/cells10020240.[2]   Chen, Y., Tristan, C.A., Chen, L., et al. (2021). A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods 18, 528–541.[3]   Vallone, V.F., Telugu, N.S., Fischer, I., et al. (2020). Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub- Cloning of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol 55.[4]   Krol, R.P., Yamashita, M., Tsukahara, M., et al. (2021). Single-cell cloning of human induced pluripotent stem cells automation and protocol optimization. In International Society for Stem Cell Research.[5]   Craig-Mueller, N., Hammad, R., Elling, R., et al. (2020). Modeling MyD88 Deficiency In Vitro Provides New Insights in Its Function. Front Immunol 11, 3327.[6]   Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., et al. (2014). Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521–based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols 2014 9:10 9, 2354– 2368.[7]   Kuo, H.H., Gao, X., DeKeyser, J.M., et al. (2020). Negligible- Cost and Weekend-Free Chemically Defined Human iPSC Culture. Stem Cell Reports 14, 256–270.