一、實驗材料: 疾病對應(yīng)的細(xì)胞系(或者是原代細(xì)胞),預(yù)算充足情況下可以選擇2種細(xì)胞系,暫定為:A和B細(xì)胞
二、實驗方案:敲低兩種細(xì)胞的目的基因1、過表達(dá)兩種細(xì)胞的目的基因1(若是miRNA可以使用mimics、inhibitor)
三、干擾片段篩選:2種細(xì)胞都需要篩選(當(dāng)用mimics和inhibitor時也需要初步篩選表達(dá)效果)
目的基因1干擾片段篩選:針對目的基因1設(shè)計并合成3條siRNA及NC,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,QPCR篩選出干擾 的片段進(jìn)行后續(xù)實驗;
四、實驗分組:A或B細(xì)胞
A
A+siRNA NC對照組
A+siRNA目的基因1干擾
A+過表達(dá)目標(biāo)基因1
A+過表達(dá)空載
抑制劑處理濃度1
五、檢測項目:
細(xì)胞增殖或者細(xì)胞毒性檢測(CCK法/MMT),
流式檢測細(xì)胞周期,
流式檢測細(xì)胞凋亡,
細(xì)胞侵襲實驗(transwell),遷移、劃痕
WB檢測細(xì)胞信號通路中蛋白的表達(dá)變化,
QPCR檢測信號通路中基因的表達(dá),
免疫熒光檢測下游信號通路蛋白
流式多色檢測某些marker指標(biāo)
Coip檢測A和B蛋白是否結(jié)合
雙熒光素酶檢測A和B是否結(jié)合
油紅O染色
生化檢測:SOD,CAT等
透射電鏡
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