液相色譜層析分離按其固定相的性質(zhì)可分為凝膠色譜、疏水性液相色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和液相色譜以及聚焦液相色譜等類型。用不同類型的液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。
液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。
1、進(jìn)樣系統(tǒng) 　　一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣器完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2、輸液系統(tǒng) 　　該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47~4.4×107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。
3、分離系統(tǒng) 　　該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為2～5mm，由"不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基團(tuán)基本已除去）、多孔性（孔徑可達(dá)1000?）和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基團(tuán)（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)。基質(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。 　　再者，液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
4、檢測系統(tǒng) 　　液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。 ?。?）紫外檢測器 　　該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點(diǎn)：使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10?g/ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測器 　　凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7?g/ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。
（3）熒光檢測器 　　凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14?g/ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。
（4）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 　　該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
文章關(guān)鍵詞：液相色譜層析分離