概述

經典條件性恐懼，是評估恐懼學習和記憶的可靠模型。在條件性恐懼期間，動物學會將先前的非威脅性刺激（指-定為條件刺激或CS）與先天有害刺激（指-定為非條件刺激或US）聯系起來。如果這種CS-US關聯被成功學習和記住，先前中性的CS本身將成為US的預測因子，從而引發(fā)原來US觸發(fā)的恐懼反應（指-定為條件反應或CR）。另外，在此過程中，動物還會學習到情境與US的關聯。

實驗設備

條件性恐懼實驗設備的主要和基本組成部分是：條件性恐懼測試室、隔音通風箱和控制軟件。測試室具有導電格柵的地板、電擊發(fā)生器以及紅外探測器，測試室通常由透明有機玻璃制成，可將小鼠的嵌套在大鼠的測試室中。其實大鼠尺寸的測試室也可以用于小鼠。為了防止動物在受到厭惡刺激時會跳出測試室，強烈建議測試室設置為有頂蓋的。測試室放置在隔音箱中，隔音箱配備有一個照明燈、一個小風扇、聲音發(fā)生器以及一個與聲音發(fā)生器相聯的擴音器、攝像機和錄音設備。風扇用于通風和產生背景噪音，這對于以聲音作為CS的情況尤其重要。不同刺激的呈現由具有相應軟件的計算機控制。

VisuFcs條件性恐懼實驗系統(tǒng)，型號：XR-XC404,上海欣軟

動物的行為通常由安裝在頂部的攝像機或位于測試室周圍框架中的紅外傳感器記錄。視頻記錄或來自紅外傳感器的信號可以使用指-定的軟件自動分析。另一種選擇是在事件記錄器軟件的幫助下人工分析視頻記錄。其他組件包括用于改變測試環(huán)境外觀的備用地板和墻板等。特定的測試室尺寸可能會有所不同，但是它們必須適合動物（例如，格柵地板間距對大鼠來說更寬），并允許自由移動和探索。對于聽覺條件恐懼范式，可以安裝一個動物不可見的LED指示燈在測試小室內，可以用于在沒有音軌的視頻記錄上指示聲音刺激的呈現。

實驗動物

1、由于跨物種恐懼環(huán)路的保守性，所有品系的實驗室大鼠和小鼠都可用于經典的條件性恐懼范式。一般來說，條件性恐懼行為測試的一個重要考慮因素是嚙齒動物在實驗時的年齡。條件性恐懼反射可以在任何年齡的動物身上建立，然而，在非常年幼和青少年的動物中，學習和記憶表型與成年動物有很大的不同。對于學習和記憶能力缺陷或增強的一般表型，一般使用成年動物（通常周齡在8至16周之間）。

2、從實驗動物供應商處訂購進入設施的動物應被允許適應新的飼養(yǎng)條件一周或更長時間。

3、實驗動物應飼養(yǎng)在光照、溫度和潛在應激源（如籠子變化、同籠數量或其他干擾）的統(tǒng)一條件下。

4、除非情況要求單籠飼養(yǎng)（如手術后的動物或具有高度攻擊性的動物），否則不應單獨飼養(yǎng)嚙齒動物，因為這可能會對行為結果產生不利影響。大鼠通常每個籠子飼養(yǎng)兩到三只，而每個籠子最多可以飼養(yǎng)五只小鼠。對于具有攻擊性的小鼠品系，例如C57BL/6小鼠，每籠飼養(yǎng)的雄性小鼠少于5只可能是最佳的。

5、每個實驗組所需的動物數量應通過功效分析確定。通常一般情況下7-10只大鼠或10-15只小鼠可以提供足夠的統(tǒng)計功效。

關鍵參數

1. CS

在經典條件性恐懼實驗中，CS幾乎可以是任何離散的非威脅性線索，例如聲音，光線或氣味。在聽覺條件性恐懼中，常用的CS是一種使用單一頻率音調的中性非有害聲音, 例如，2-10 kHz范圍內的聽覺刺激，其強度約為80 dB。CS呈現的持續(xù)時間因研究而異，范圍從2 s到30 s不等。

2. US

US是有害的或輕度疼痛的。最-常-用的US是輕度電擊，電刺激的優(yōu)點是它們的參數定明確，并且易于控制和管理。如果對動物的腳施加電刺激，它們也被稱為“足部電擊”。電刺激的強度和持續(xù)時間不同，強度可能在 0.4 至 1 mA之間變化，持續(xù)時間通常為 0.5 s至 2 s 之間。

3. 跟蹤配對刺激

當 CS 和 US 在整個測試中重復出現但兩者不是同時出現時，稱為跟蹤配對刺激（圖1）。US通常在CS呈現結束后的相對較短的固定時間間隔內出現，一般約10 - 20 s，但足以在CS和US之間形成聯系。但是幾個CS-US配對之間時間間隔要長一些，大約2.5 - 4.5 min。

4. 延遲配對刺激

當US與CS的呈現共同終止（即，電擊在CS結束時精確地傳遞），這被稱為延遲配對刺激（圖1）。在正常情況下，條件反應在延遲配對刺激處理中比在跟蹤配對刺激中更強，因為CS-US配對在時間上更緊密地聯系在一起。跟蹤配對刺激激活海馬，而延遲配對刺激主要激活杏仁核。因此，選擇哪種范式將取決于所要解決的科學問題。

圖 1：跟蹤配對刺激與延遲配對刺激條件性恐懼的示意圖

實驗程序（測試方法）

1、線索條件性恐懼測試（cued fear conditioning）

2、情境條件性恐懼測試

3、恐懼增強性驚嚇

4、條件性恐懼記憶的消退

凍結時間通常表示為 CS 持續(xù)時間的百分比，并在每次測試中取平均值。例如，如果一只動物在30秒的長CS呈現過程中凍結了24秒，就代表它在該試驗中顯示出80%的凍結反應。評價情境恐懼時，可以使用凍結時間占整個測試持續(xù)時間的百分比作為統(tǒng)計指標。對于消退測試，應對測試中的每個CS進行單獨分析，而不是取平均值，因為凍結行為會逐漸減少。如果CS呈現的數量非常多，單獨分析每個CS下的凍結行為導致曲線非常雜亂，則可以將連續(xù)幾個（2-5個）CS作為一個試驗塊，將每個試驗塊的數據平均，這可能有助于簡化曲線。在情境恐懼消退的情況下，可以將測試分解為例如 1 或 2 分鐘的間隔，以評估恐懼消退的獲得。另一個不太常用的參數是凍結行為次數，以總數表示。

驚嚇反應顯示出一定程度的個體內和個體間變異性，因此需要進行較多試驗，并且推薦匹配方式分組，即根據基線驚嚇反應將小鼠或大鼠分配到實驗組和對照組，以確保在實際實驗開始之前各組均值彼此之間沒有差異。除了恐懼CS 驚嚇刺激試驗外，還包含單獨的驚嚇刺激試驗。對“單獨驚嚇”和“CS驚嚇”的平均反應的差異稱為恐懼增強，以絕對值或“單獨驚嚇”幅度的百分比變化來表示。

通常建議不要只分析條件性恐懼的單一測量，特別是如果使用的設置和/或方案允許測試更多的恐懼反應。例如，動物可以將恐懼反應從凍結行為轉換為逃跑反應。這種逃跑反應也可以通過跟蹤軟件中的速度閾值自動檢測。如果不知道逃跑反應在實驗中增加，那么在這個實驗中觀察到凍結減少將被錯誤地解釋為恐懼減少。