在SBF中檢查DC-S53P4雜交凝膠支架的無細胞生物活性長達7天。對DC-S53P4的SEM顯微照片的定性研究表明，SBF中礦物的形成水平隨時間的變化而增加（圖2A）。相比之下，僅DC在SBF的7天內(nèi)顯示出礦物形成的證據(jù)很少（圖。S1）。DC-S53P4 的 ATR-FTIR 光譜（圖 2B）表明 v3 PO 的吸收帶隨時間變化增加43?在 1022 厘米?1， v4 采購訂單43?在 560 和 600 厘米?1， v2 一氧化碳32?在 873 厘米?1和 v3 一氧化碳32?在 1460 厘米?1以及 v1 PO 的強化43?在 960 厘米?1，均提示HCA在膠原基質(zhì)內(nèi)的形成和生長[38]。此外，S53P4的XRD衍射圖（圖2C）顯示出無定形玻璃的特征圖案，而制造的DC-S53P4在約20°2 θ處表現(xiàn)出寬衍射圖案，這歸因于膠原纖維的隨機取向[10]。在SBF中6小時后，這種無定形的寬衍射駝峰變得更小，不那么突出。隨著浸泡時間的進一步延長，從第1天開始觀察到與特征羥基磷灰石有關(guān)的峰（ICDD參考號009-432，圖2D），這在更長的時間內(nèi)變得更加明顯。峰的增加和變窄不僅表明DC-S53P4支架內(nèi)羥基磷灰石的增加，而且表明支架通過暴露于SBF從無定形結(jié)構(gòu)到晶體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。相比之下，SBF中的直流腳手架（圖1000）。S1）在ATR-FTIR光譜中未顯示表明磷酸鹽含量增加的峰，并且XRD模式僅顯示第7天寬峰色散的輕微指示，類似于在SBF中6 h后DC-S53P4的模式。微機械壓縮測試表明，在SBF的7天內(nèi)，DC-S53P4的剛度增加了8倍（圖3）。直流與S53P4雜交和SBF時間（p<0.0001和p<0.01）的壓縮模量均有統(tǒng)計學(xué)意義增加，而僅直流支架的壓縮模量隨SBF浸泡時間的增加沒有顯著增加（p>0.05）。

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圖 2.無細胞DC-S53P4支架在SBF中的礦化進展.（A） 在 SBF 中第 （I） 天、第 1 天 （II） 第 3 天和第 （III） 7 天時 DC-S53P4 的掃描電鏡圖像，（IV） 在第 7 天顯示 DC-S53P4 的放大倍率較高。所有比例尺 = 5 μm。（B） 指紋區(qū)域的 ATR-FTIR 光譜，描繪了 DC-S53P4 在 SBF 中 7 天內(nèi)的礦化情況。（C） SBF 中 DC-S53P4 的 XRD 圖譜和 （D） 羥基磷灰石的參考 XRD 圖譜 （ICDD 9–432）。無花果。S1 顯示了超低頻中直流的掃描電鏡、反光柵光譜和 XRD。

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圖 3.通過礦化改變腳手架機械性能。在 SBF 中 7 天內(nèi) （A） 直流和 （B） DC-S53P4 的代表性壓應(yīng)力-應(yīng)變曲線。（C）直流和DC-S53P4中平均壓縮模量隨時間的變化在SBF中。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗，誤差線± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

為了驗證DC-S53P4支架的細胞反應(yīng)和成骨潛力，在對照和成骨培養(yǎng)基（分別為CM和OGM）中在支架中培養(yǎng)接種的hDPSC長達28天。在DC-S53P4中接種的hDPSC的代謝活性最初增加后，作為培養(yǎng)時間的函數(shù)略有減少（圖4A）。在DC中接種并在CM中培養(yǎng)的hDPSC的代謝活性似乎在第7天達到峰值，隨后隨著培養(yǎng)時間的增加而降低。從第14天開始，觀察到在所有條件下培養(yǎng)的細胞的代謝活性是穩(wěn)定的。第7天的活/死分析證實CM和OGM中死細胞的存在最?。?/span>圖4B）。第28天，通過使用Hoechst測定法（圖4C）測量DNA來量化支架內(nèi)的細胞數(shù)量，每個支架的細胞數(shù)量都在150，000至170，000個細胞之間，并且在CM和OGM中DC和DC-S53P4之間沒有顯著差異，表明所有支架中的平衡細胞數(shù)量。

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圖 4.接種的hDPSC在DC和DC-S53P4支架中的代謝活性和活力。（A）接種在（I）DC和（II）DC-S53P4中的hDPSCs的代謝活性，如阿拉瑪藍®還原測定在對照（CM）和成骨培養(yǎng)基（OGM）中長達28天所示。（B）在第7天接種在DC-S53P4中的hDPSCs的活/死圖像，分別在（I）CM和（II）OGM中用綠色和紅色熒光指示活細胞和死細胞。比例尺 = 200 μm。（D）第28天存在的細胞數(shù)量，通過CM和OGM的赫希斯特33258 DNA測定進行定量。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗，± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和無顯著性 （ns） > p 為 0.05。（為了解釋此圖例中對顏色的引用，讀者請參閱本文的網(wǎng)絡(luò)版本。

進行組織學(xué)分析以評估DC和DC-S53P4支架的細胞分散和礦化潛力。Masson的三色在所有條件下都顯示出均勻的細胞在兩個基質(zhì)上的分散，而茜素紅和Von Kossa染色表明，無論添加生物活性玻璃，當應(yīng)用OGM時，鈣和磷酸鹽的沉積分別增加（圖5A）。組織學(xué)分析證實了生物活性玻璃對礦化的影響，其中在無細胞DC-S53P4支架內(nèi)觀察到輕微的礦化跡象（圖.S3）。

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圖 5.hDPSC種子直流和DC-S53P4支架的礦化和成骨分化。將支架在對照組（CM）和成骨培養(yǎng)基（OGM）中培養(yǎng)，并在第28天使用組織學(xué)分析和蛋白質(zhì)印跡進行評估。（A）馬森三色，茜素紅和馮·科薩的組織學(xué)染色。所有比例尺均為 100 μm。（B）ALP，I型膠原蛋白和β肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡（3個獨立實驗）。（C）ALP和I型膠原蛋白的定量。數(shù)據(jù)以歸一化為β肌動蛋白。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗，SD 和 *p ±誤差線< 0.05、**p < 0.01。（為了解釋此圖例中對顏色的引用，讀者請參閱本文的網(wǎng)絡(luò)版本。