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抗體藥物純化工藝中最關(guān)鍵的首要步驟使用Protein A填料進(jìn)行親和分離。通過這一步，抗體純度可達(dá)到95%左右。但作為抗體藥物，純度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要進(jìn)行進(jìn)一步純化。主要雜質(zhì)包括多聚體、抗體片段，來自宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)（HCP）和DNA、病毒、以及自Protein A填料脫落下來的Protein A配基。這些雜質(zhì)可以通過陰離子交換填料和陽離子交換填料（或混合模式填料）或疏水填料去除。除此之外，往往也會使用陽離子交換填料通過吸附、洗脫模式來進(jìn)行抗體的純化。
TOYOPEARL Sulfate-650F是一款具有硫酸根官能團(tuán)的耐鹽型陽離子交換填料。對抗體的吸附載量高，可以有效地去除多聚體，宿主細(xì)胞蛋白以及脫落的Protein A配基。
l 高載量?耐鹽型陽離子交換填料Toyopearl Sulfate-650F的產(chǎn)品特性
? 是一款具有耐鹽性的（salt-tolerant）陽離子交換填料，在較高的鹽濃度下對抗體也有較高的載量。
? 填料的孔徑大，可以有效去除抗體的多聚體、宿主細(xì)胞蛋白（HCP）以及其他雜質(zhì)。
? 具有很好的耐堿性，可以使用0.1 mol/L或者0.5 mol/L NaOH溶液重復(fù)對填料進(jìn)行清洗和再生。
? 可以有效地去除病毒。
? 為了方便初期的填料篩選，配備了專門的ToyoScreen®（1 mL， 5 mL）, MiniChrom® （5 mL）預(yù)裝柱。
l 使用吸附、洗脫模式純化抗體
分離條件：
層析柱：Toyopearl Sulfate, 6.6 mmI.D.× 3.0 cm (1.0mL)
緩沖液：吸附 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.1 mol/L NaCl
洗脫 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.26 mol/L NaCl
洗脫 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.29 mol/L NaCl
洗脫 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.32 mol/L NaCl
清洗 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 1.0 mol/L NaCl
堿清洗 0.5 mol/L NaOH
流速 ：45 cm/hr （4分鐘保留時間）
檢測 ：UV (280 nm)
溫度 ：室溫
樣品 ：通過Protein A層析后收集的單抗（19.1 g/L）
純化后的雜質(zhì)含量 | Protein A純化后 | Sulfate-650F純化后 |
樣品負(fù)荷量（mg/mL填料） | 48 | 101 |
單體回收率（%） | n/a | 83 |
二聚體（%） | 3.90 | 2.40 |
多聚體（%） | 0.54 | 0.07 |
HCP（ppm） | 1,260 | 134 |
Protein A配基（ppm） | 1.20 | 0.04 |
* Protein A純化步驟均使用Toyopearl AF-rProtein A HC-650F。
※大量的樣品進(jìn)行上樣（100 mg/mL充塡剤）、用鹽濃度為0.26 mol/L 的NaCl進(jìn)行洗脫。純化結(jié)果，單體的回收率為83%，多聚體、HCP、脫落的Protein A配基等雜質(zhì)均被有效地去除。
參考資料： Application Note; Increase monoclonal antibody purity with TOYOPEARL Sulfate-650F resin; Strong cation-exchange resin for capture and
removal of mAb Aggregates, Tosoh Bioscience LLC (2016).
l 使用Protein A填料的抗體純化的層析工藝案例
*使用流穿模式（FT）的情況下，根據(jù)抗體的種類來優(yōu)化填料的粒徑以及緩沖液的鹽濃度，一般來說推薦使用160mM以上的鹽濃度。
Protein A填料 ： TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F
陽離子交換填料 ： TOYOPEARL Sulfate-650F, GigaCap S-650M, GigaCap CM-650M
： TOYOPEARL MX-Trp-650M（陽離子交換型混合模式填料）
陰離子交換填料 ： TOYOPEARL NH2-750F, GigaCap Q-650M, GigaCap DEAE-650M
疏水填料 ： TOYOPEARL Butyl-650/600M, Phenyl-650/600M, PPG-600M, Hexyl-650C
l TOYOPEARL Sulfate-650F產(chǎn)品參數(shù)
項目 | 規(guī)格 |
官能團(tuán) | 硫酸根 |
離子交換容量（meq./L） | ≥0.53 |
粒徑（μm） | 30-60 |
靜態(tài)吸附載量（IgG./L） | ≥114 |
菌體數(shù)（CFU/mL） | ≤100 |
內(nèi)毒素（EU/mL） | ≤10 |
異物 | ≤6 |
溶出物 | ≤0.2% |
l TOYOPEARL NH2-750F填料以及篩選用預(yù)裝柱產(chǎn)品一覽表
貨號 | 產(chǎn)品名 | 離子交換容量（eq/L） | 吸附載量（g/L） | 粒徑 (μm) | 包裝 (mL) | 備注 |
0023468 | TOYOPEARL Sulfate-650F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 250 | 散裝填料 |
0023472 | TOYOPEARL Sulfate-650F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 1 mL × 6 | 篩選用預(yù)裝柱；需要同時使用ToyoScreen Holder（柱套） |
0023473 | TOYOPEARL Sulfate-650F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 5 mL × 6 | 篩選用預(yù)裝柱；需要同時使用ToyoScreen Holder（柱套） |
0045117 | MiniChrom Sulfate-650F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 5 mL | 預(yù)裝柱：8 mm ID × 10 cm |
0021400 | ToyoScreen Holder | - | - | - | - | 預(yù)裝柱配套用柱套 |
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