液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱,或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)(ODS)稱(chēng)為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。
色譜柱在使用前,最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試,并將結(jié)果保存起來(lái),作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件),只有這樣,測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。
所以在實(shí)驗(yàn)室最好建立自己的色譜柱臺(tái)賬,對(duì)每根色譜柱進(jìn)行編號(hào)入庫(kù)、并追蹤其使用過(guò)程,實(shí)現(xiàn)全生命周期化管理。每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)記錄其柱壓、峰型、進(jìn)樣針數(shù)等信息。
新買(mǎi)的液相色譜柱需要活化,活化的方法因柱子而異,普通反相C18柱的話我是這樣活化的:0.5ml/min流速的甲醇沖洗2小時(shí)以上。液相的新色譜柱都是保存在一定的保存液中的,所謂的活化就是替換掉其中的保存液,沖洗掉柱中可能殘留的其他雜質(zhì),以免影響后續(xù)分析工作。
不同的色譜柱活化的方法不盡相同,要根據(jù)柱子的種類(lèi)來(lái)選擇活化方法。另外,要提醒的是,柱子活化時(shí)不要接檢測(cè)器,避免不必要的污染。
1.排除有機(jī)相揮發(fā)所產(chǎn)生的起泡。
2.柱子一般是鍵合了c18的,用甲醇沖柱子就是使得這些集團(tuán)達(dá)到更好的排列,有利于我們做樣。就像剛買(mǎi)的電池。
柱的維護(hù)分為:色譜柱的平衡、色譜柱的再生、最后才是色譜柱的維護(hù)。
1. 色譜柱的平衡
反相色譜柱由工廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來(lái)平衡色譜柱,您就會(huì)在處理問(wèn)題方面獲得最大的"補(bǔ)償",而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長(zhǎng)!
操作步驟:
a. 平衡開(kāi)始時(shí)將流速緩慢地提高,用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(緩沖鹽或離子對(duì)試劑流速如果較低,則需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡)
b. 如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽,應(yīng)注意用純水"過(guò)渡"即每天分析開(kāi)始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡; 分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。
2. 色譜柱的再生
長(zhǎng)期使用的色譜柱,往往柱效會(huì)下降(柱子的理論塔板數(shù)減低)??梢詫?duì)色譜柱進(jìn)行再生,在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生。
選擇再生方法:
極性固定相(如Si,NH2* ,DIOL基色譜填料)的再生:
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水
非極性固定相(如反相色譜填料RP-18,RP-8,CN等)的再生:水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水
注意:
a. 在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí),由于NH2可能以銨根離子的形式存在,因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗,然后再用水沖洗至堿溶液*流出。
b. 0.05M稀硫酸可以用來(lái)清洗已污染的色譜柱,如果簡(jiǎn)單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì),在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
3. 色譜柱的維護(hù)
a.使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度)
b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5,盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍
c.避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化
d.流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理
e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相,應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈,并保存于甲醇或乙腈中
f.氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性,故使用時(shí)要注意,柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類(lèi)溶劑,以避免腐蝕。
1、液相色譜柱色譜柱使用前注意事項(xiàng):
液相色譜柱的儲(chǔ)存液無(wú)特殊說(shuō)明,均為評(píng)價(jià)報(bào)告所示的流動(dòng)相。在使用前,一定要注意液相色譜柱的儲(chǔ)存液與要分析樣品的流動(dòng)相是否互溶。在反相色譜中,如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑,應(yīng)先用10%左右的低濃度的有機(jī)相洗脫劑過(guò)渡一下,否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機(jī)相中很容易析出,堵塞色譜柱。
2、流動(dòng)相:
流動(dòng)相中所使用的各種有機(jī)溶劑要盡可能使用色譜純,配流動(dòng)相的水最好是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動(dòng)相再經(jīng)過(guò)0.45μm 的濾膜過(guò)濾一次則更好,尤其是含鹽的流動(dòng)相。另外,裝流動(dòng)相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過(guò)濾器等裝置應(yīng)該定期清洗或更換。
但如果您實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)有液質(zhì)與液相的話,建議液質(zhì)的流動(dòng)相不要輕易過(guò)膜,容易出現(xiàn)交叉污染,或者液質(zhì)使用專(zhuān)門(mén)的過(guò)膜儀器。
液相與液質(zhì)混用過(guò)膜裝置,導(dǎo)致三乙胺進(jìn)入質(zhì)譜,響應(yīng)突然下降,一定會(huì)讓您痛不欲生的。。。。。。。
以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的pH值適用范圍是2.0-8.0。當(dāng)必須要在pH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時(shí),每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱儲(chǔ)存并與所使用的流動(dòng)相互溶的溶劑清洗,并*置換掉原來(lái)所使用的流動(dòng)相。不同填料的色譜柱,PH、柱溫的范圍是不一樣的
3、樣品:
樣品也要盡可能清潔,可選用樣品過(guò)濾器或樣品預(yù)處理柱(spe)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理;若樣品不便處理,要使用保護(hù)柱。在用正相色譜法分析樣品時(shí),所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫水。
這個(gè)看看就可以了,怎么可能每個(gè)樣品都過(guò)膜或用SPE進(jìn)行處理,先不說(shuō)麻不麻煩,試驗(yàn)成本就不用考慮了。。。。。太敗家了
一般樣品高速離心就可以了,但需注意取上清時(shí),不要取到下面的沉淀物質(zhì)以及色譜柱前最好加裝 預(yù)柱或在線過(guò)濾器
a反相液相色譜柱色譜柱每天實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng):
使用緩沖液或含鹽的流動(dòng)相,實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘,洗掉色譜柱中的鹽,再用甲醇沖洗30分鐘。注意:不能用純水沖洗柱子,應(yīng)該在水中加入10%的甲醇,防止將填料沖塌陷。
在使用過(guò)程中也最好不要用到純水比例的流動(dòng)相,除非是特殊的親水性柱子,例如waters 的T3柱,是耐水的,不然柱子一不小心就玩壞了
b長(zhǎng)期保存色譜柱:
如色譜柱要長(zhǎng)時(shí)間保存,必須存于合適的溶劑下。對(duì)于反相柱可以?xún)?chǔ)存于純甲醇或乙腈中,正相柱可以?xún)?chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中,離子交換柱可以?xún)?chǔ)存于水(含防腐劑或柳硫汞)中,并將購(gòu)買(mǎi)新色譜柱時(shí)附送的堵頭堵上。儲(chǔ)存的溫度最好是室溫。
色譜柱在使用中常見(jiàn)的問(wèn)題:就是柱壓升高,如果柱壓是在長(zhǎng)時(shí)間使用過(guò)程中緩慢增加,屬于正?,F(xiàn)象。但柱壓在使用過(guò)程中突然升高(系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外),可能的原因有如下幾點(diǎn):
(1)色譜柱頭的過(guò)濾篩板堵塞或污染;
(2)色譜柱頭的填料被樣品污染;
(3)色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑,形成結(jié)晶析出;
(4)流動(dòng)相pH值過(guò)大或過(guò)小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。
解決辦法如下:
(1)如確定是色譜柱頭的過(guò)濾篩板被污染,可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力,或者卸下色譜柱頭,將其放在10%的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘,后再用純水超聲10分鐘,重新裝入色譜柱。
(2)如確定色譜柱頭的填料被污染,將柱頭螺絲卸下,挖出柱內(nèi)前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔細(xì)修復(fù)后,重新安裝上柱頭螺絲。
(3)如確定定是鹽結(jié)晶,用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解,再換高濃度甲醇。
(4)如果因pH值使用不當(dāng),很難恢復(fù)。
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