表觀遺傳信息的調(diào)控和異常在眾多的生理、病理中起著至關(guān)重要的作用。胞嘧啶衍生物可以調(diào)控基因表達(dá)。但是，單細(xì)胞水平上遺傳信息標(biāo)記物的定量評估受到了較低的時(shí)空分辨率和信噪比成像方法的限制。所以，很少有人對不同類型細(xì)胞和不同細(xì)胞階段的這些胞嘧啶修飾位點(diǎn)進(jìn)行表征研究。
高光譜成像技術(shù)（Hyperspectral Imaging）有著*的空間分辨率和光譜分辨率，可以輕松獲得視野內(nèi)上某一個(gè)像素點(diǎn)的光譜信息。暗場成像（Dark-Filed）的方式可以排除未散射的入射光束，得到清晰的背景。將高光譜成像技術(shù)與暗場成像方式相結(jié)合（Hyperspectral Dark-Field Imaging，HSDFI）可以確定生物組織中等離子體納米顆粒的位置和成分。2015年，美國普渡大學(xué)JosephIrudayaraj課題組在《ACS Nano》上發(fā)表文章“Single-CellQuantification of Cytosine Modifications by Hyperspectral Dark-Field Imaging”，提出了一種在單細(xì)胞水平上檢測胞嘧啶修飾位點(diǎn)的方法。具體內(nèi)容如下：

等離子體納米探針用于胞嘧啶修飾的檢測

作者選用DNA修飾的一抗和包含AuNPs和AgNPs的二抗來平衡空間位阻，結(jié)合效率和信噪比。等離子體納米探針具有較大的局部表面等離子體共振（Local Surface Plasmon Resonance，LSPR）散射截面，這些納米探針作用于胞嘧啶的修飾位點(diǎn)會產(chǎn)生強(qiáng)信號。通過分析LSPR光譜特征和信號強(qiáng)度，可以得出等離子體納米探針的數(shù)量和局部濃度，進(jìn)而對單細(xì)胞內(nèi)胞嘧啶修飾位點(diǎn)的平均數(shù)量和區(qū)域分布進(jìn)行量化。AuNPs的LSPR峰位于537nm附近呈現(xiàn)綠色，AgNPs位于419nm附近呈現(xiàn)藍(lán)色。這組體外光學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這組納米粒子用于檢測DNA上胞嘧啶修飾位點(diǎn)的可行性（圖1，圖2）。


圖1：胞嘧啶修飾位點(diǎn)的成像和量化示意圖；（a）抗體修飾胞嘧啶位點(diǎn)原理圖；（b）單細(xì)胞內(nèi)胞嘧啶修飾位點(diǎn)和局部修飾的濃度的高光譜信息

圖2：AuNPs和AgNPs的高光譜暗場成像和光譜表征示意圖

單細(xì)胞內(nèi)胞嘧啶修飾位點(diǎn)的量化

對胞嘧啶修飾位點(diǎn)進(jìn)行檢測可以評估量化效率。作者檢測了5caC的細(xì)胞周期依賴性豐度。盡管在體細(xì)胞中，5mC的圖像可以在新合成的DNA鏈上重建，但是目前還不清楚其他改性的胞嘧啶的豐度是否也能在“后代”中穩(wěn)定的遺傳。因此，作者進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來評估不同細(xì)胞階段的5caC水平。研究表明，5caC在G2M階段的含量是G1的兩倍。單個(gè)染色體上的5caC的局部濃度也可以用HSDFI進(jìn)行繪制，5caC在著絲粒處的密度明顯高于端粒處，重構(gòu)的光譜圖也進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞核和單個(gè)染色體上的5caC的密度（圖3）。

圖3：5caC在MCF-7細(xì)胞的不同階段的成像和量化；（a）樣品細(xì)胞在G2/M階段和G1階段的高光譜暗場圖像；（b）不同細(xì)胞期5caC的數(shù)量；（c）5caC在單條染色體分布的高光譜暗場圖像；（d）端粒和著絲粒上納米探針的LSPR譜圖；（e）5caC在單條染色體上分布的熒光成像；（f）5caC在細(xì)胞核和單條染色體上的光譜重建圖像

HSDFI精確性的驗(yàn)證

為了證明HSDFI的精確性，作者選用兩種細(xì)胞系對胞嘧啶的修飾位點(diǎn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)（5caC在HeLa細(xì)胞和SF767細(xì)胞，5fC在HeLa細(xì)胞），并使用HSDFI的濾波功能可以對胞嘧啶改性的DNA進(jìn)行量化。研究表明，5caC在SF767細(xì)胞和Hela細(xì)胞的比值約為1.97，SF767細(xì)胞中5caC水平高于5fC，比值約為1.56，這些結(jié)果說明了5caC比5fC更穩(wěn)定（圖4）。

圖4：HSDFI的濾波功能可以實(shí)現(xiàn)胞嘧啶修飾的精確量化；（a）利用HSDFI的濾波功能對原始圖像進(jìn)行優(yōu)化；（b）不同細(xì)胞納米粒子的高光譜圖像和數(shù)量

胞嘧啶修飾位點(diǎn)的多重檢測

為了評估HSDFI用于多重檢測的有效性，作者選用30nm的AuNPs和20nm的AgNPs進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。根據(jù)散射光的顏色和光譜特征來區(qū)分納米探針（綠色為AuNPs，藍(lán)色為AgNPs）。納米粒子的位置信息和相互作用可以用HSDFI成像技術(shù)來分析。高光譜圖像上AgNPs和AuNPs的LSPR峰位沒有發(fā)生偏移，納米粒子之間的間距約為1 nm，說明AuNPs和AgNPs沒有發(fā)生耦合和團(tuán)聚，耦合之后的峰形明顯的偏移。這些結(jié)果表明HSDFI可以評估表觀遺傳修飾位點(diǎn)的數(shù)量和相互作用（圖5和圖6）。

圖5：AuNPs和AgNPs的表征；（a）納米粒子的暗場成像；（b）AgNPs和AuNPs的紅外譜圖

圖6：細(xì)胞中5caC和5mC的檢測；（a）5caC和5mC的高光譜圖像；（b）a圖中圈內(nèi)三個(gè)點(diǎn)的光譜信息；（c）b圖中的模擬光譜圖；（d-g）光譜譜線信息的二維圖像

總結(jié)：作者進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)證明了HSDFI可以在單細(xì)胞水平上對多重表觀遺傳標(biāo)記的修飾位點(diǎn)進(jìn)行量化和成像。這是單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)定量領(lǐng)域的shouci嘗試之一，為未來臨床診斷中更全面的細(xì)胞分析和組織評估奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
[1] X, Wang, Y. Cui, and J. Irudayaraj. Single-CellQuantification of Cytosine Modifications by Hyperspectral Dark-Field Imaging[J]. ACS Nano, 2015, 9(12): 5b04451.