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實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR檢測技術(shù)誕生以來，越來越受到實驗室老師的青睞。
熒光定量PCR原理：熒光定量PCR早稱TaqManPCR，后來也叫Real-TimePCR，是美國PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。
一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量也不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。
熒光域值（threshold）：是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10XSDcycle6-15。熒光域值設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期。
Ct值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
Ct值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值如下圖所示。
因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
其中：Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍，Ct值也會存在差異。
熒光定量檢測：熒光定量檢測根據(jù)所使用的標(biāo)記物不同可分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包括Beacon技術(shù)（分子信標(biāo)技術(shù)，以美國人Tagyi為代表）、TaqMan探針（以美國ABI公司為代表）和FRET技術(shù)（以羅氏公司為代表）等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在常用的SYBRGreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LCGreen等。
SYBRGreenI是熒光定量PCR常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)的雙鏈DNA量呈比列，且會隨擴增產(chǎn)物的增加而增加。
雙鏈DNA結(jié)合染料的優(yōu)點：實驗設(shè)計簡單，僅需要2個引物，不需要設(shè)計探針，無需設(shè)計多個探針即可以快速檢驗多個基因，且能夠進(jìn)行熔點曲線分析，檢驗擴增反應(yīng)的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
熒光探針法（Taqman技術(shù)）：PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，PCR儀檢測不到熒光信號；PCR擴增時（在延伸階段），Taq酶的5'－3'切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。
熒光定量PCR的應(yīng)用：
分子生物學(xué)研究:
1.核酸定量分析。對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測,比如近期流行的甲型H1N1流感，轉(zhuǎn)基因動植物基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。
2.基因表達(dá)差異分析。比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)，特定基因在不同時相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證
3.SNP檢測。檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的SNP檢測將會變得簡單而準(zhǔn)確。
4.甲基化檢測。甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥，Laird報道了一種稱作Methylight的技術(shù)，在擴增之前先處理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
醫(yī)學(xué)研究：
1.產(chǎn)前診斷：人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。
2.病原體檢測：采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點。
3.藥物療效考核：對乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。
4.腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量。目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。
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