細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)注意事項(xiàng)大匯總:

1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。

2. 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以 70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。

3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)(至少 Class II)。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2壓力 5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無(wú)菌水，每周更換)。 5.3. 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

7. 認(rèn)真按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一般不大會(huì)導(dǎo)致污染，很多情況下是由于所用的試劑或培養(yǎng)基有污染而使實(shí)驗(yàn)失敗。

8. 粉末培養(yǎng)基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過(guò)1個(gè)月，如在-20度存放時(shí)間可長(zhǎng)一些，但也不要超過(guò)3-4個(gè)月，可能對(duì)于永生化細(xì)胞株來(lái)說(shuō)要求不是太高，但我在過(guò)去的4年里一直是作原代 細(xì)胞培養(yǎng) 的，細(xì)胞嬌弱，經(jīng)驗(yàn)表明放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

9. 關(guān)于實(shí)驗(yàn)用品的清洗與消毒，我的經(jīng)驗(yàn)是：用過(guò)的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無(wú)超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過(guò)夜)后，自來(lái)水清洗10-15遍，雙蒸水清洗3-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。

10. 許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養(yǎng)瓶蓋，膠塞，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了，當(dāng)然如果 money有限，如進(jìn)口的培養(yǎng)板、皿等，也可以重復(fù)使用1-2次，我當(dāng)時(shí)使用方法是將其*清潔后，使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可，我做過(guò)多次，沒(méi)有出現(xiàn)問(wèn)題。塑料培養(yǎng)瓶由于清洗消毒不便，不要重復(fù)使用，如一定要重復(fù)用，可用環(huán)氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)。

11. 在光鏡下，上皮細(xì)胞通常呈“鋪路石”樣排布，細(xì)胞之間有拉絲現(xiàn)象(即距離較遠(yuǎn)的細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)長(zhǎng)的觸手相連)，細(xì)胞有成片生長(zhǎng)的特性。而間質(zhì)細(xì)胞通常呈梭形，沒(méi)有有成片生長(zhǎng)的特性，細(xì)胞之間的聯(lián)系不緊密。但是細(xì)胞的形態(tài)特征會(huì)因?yàn)樯L(zhǎng)條件的改變而改變，如HeLa細(xì)胞是上皮細(xì)胞，但是在酸性培養(yǎng)條件下會(huì)變?yōu)樗笮巍?/span>