把PCR產(chǎn)物克隆到載體上常見有3種做法：

1.  直接克隆到T載體（或者U載體上）

2.  引物設(shè)計(jì)時(shí)引入酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物酶切后直接克隆到目標(biāo)載體上

3.  將平末端PCR產(chǎn)物直接克隆到平末端酶切載體上。

方法3主要是針對(duì)高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，NewEnglandBiolabs公司的Vent酶，以及QIAGEN公司新出的同時(shí)具有熱啟動(dòng)功能的高保真ProofStart酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于這類酶有很強(qiáng)的校讀功能，能夠以模版為準(zhǔn)切掉錯(cuò)配的堿基，因而得到的PCR產(chǎn)物多數(shù)是平末端，不能用T載體克隆。通常需用目的載體多克隆位點(diǎn)上的平末端單酶切位點(diǎn)，單酶切得到平末端的線性片斷，直接連接PCR產(chǎn)物。這類酶得到的產(chǎn)物通常不能用TA克隆試劑盒。目前也有商業(yè)化的平末端PCR產(chǎn)物克隆試劑盒，不過較少用。平末端的連接效率低，通常需要高濃度的連接酶，較長(zhǎng)的連接時(shí)間，合適的片斷：載體比例，有的時(shí)候還需要調(diào)整反應(yīng)體系的ATP濃度或者增加聚乙二醇（PEG2000），以得到較高的連接效率。許多廠家都有推出快速連接試劑盒，比如NewEnglandBiolabs新出的5分鐘快速連接試劑盒，能夠簡(jiǎn)化平端連接步驟和條件，縮短連接時(shí)間，提高連接效率。

不過需要注意的是一些廠家（例如Clontech、Gibco/BRL、Roche）也生產(chǎn)一些用于PCR的高保真混合酶，是采用常規(guī)Taq酶和一些有校讀功能的（proofreading）的聚合酶按比例混合（這樣得到的混合酶的保真性比普通Taq酶高一點(diǎn)，但通常不如Pfu、ProofStart等酶），因而得到的PCR產(chǎn)物也是平端和A末端的混合產(chǎn)物，是否能用TA克隆試劑盒需要參考廠家的說明。

方法2是比較常用的經(jīng)濟(jì)的方法，不需要購買T載體，可以直接通過酶切PCR產(chǎn)物，得到粘末端，直接連接到目的載體上。在順的時(shí)候，這種方法是非常簡(jiǎn)單的。可有時(shí)候也會(huì)出問題，雙酶切就是連不上，比較常見的原因是PCR產(chǎn)物雙酶切不*，比如沒有純化產(chǎn)物就直接雙酶切，有的酶比較“嬌氣”容易出現(xiàn)“切不動(dòng)”或者是“星號(hào)活力”，得不到正常的粘末端而連不上。有時(shí)是因?yàn)檫x定的兩種酶反應(yīng)條件相差比較大，為了省事同時(shí)雙酶切（通用Buffer不是一定通用的，不能過分迷信，有時(shí)會(huì)成為莫名其妙出錯(cuò)的根源），也會(huì)出現(xiàn)類似的錯(cuò)誤。還有一種情況是由于有些酶在酶切時(shí)需要一定的“占位空間”，也就是要求酶切識(shí)別序列的前后有一定數(shù)量的堿基才能正常酶切，而設(shè)計(jì)引物時(shí)酶切位點(diǎn)直接就在5'末端，沒有留下足夠的保護(hù)堿基而導(dǎo)致PCR產(chǎn)物酶切不動(dòng)，無法正常的克隆。由于這些錯(cuò)誤很難檢查，有的時(shí)候會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間，還是莫名其妙沒有結(jié)果。

由于常見的Taq酶或者沒有校讀功能的DNA聚合酶（即不是高保真）在PCR擴(kuò)增的時(shí)候通常會(huì)在PCR產(chǎn)物末端多添加一個(gè)A（即增加一個(gè)模版上不存在的A）。這個(gè)突出的A成為PCR產(chǎn)物TA克隆技術(shù)的基礎(chǔ)。帶有互補(bǔ)的突出T末端的線性載體能夠有效提高PCR產(chǎn)物的克隆效率，解決方法2遇到的難題，所以方法1也是目前比較常見的方法。

TA克隆在順的時(shí)候也很簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)直就是“apieceofcake”，不用考慮酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)等等問題，好的載體克隆效率高、重組率高而且兩端有豐富的單酶切位點(diǎn)便于后繼的克隆，但是煩的時(shí)候也會(huì)出現(xiàn)無緣無故克隆不上或者重組率很低的問題。比較容易忽略的問題是用高保真的酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)該選用平端克隆載體而錯(cuò)用了TA載體。常見但很難解決的問題則是由于T末端容易和其他堿基錯(cuò)配而導(dǎo)致自身環(huán)化或者克隆了引物/自身褪火引物二聚體或者PCR不完整產(chǎn)物，因而出現(xiàn)假陽性。因而QIAGEN公司推出了UA克隆試劑盒，用突出的U末端代替T末端，由于U堿基能夠有效減低和其他堿基（T、C、G）非特異退火的幾率，因而能有效提高PCR產(chǎn)物的克隆效率。

但是，是否還有其他因素會(huì)影響PCR產(chǎn)物的克隆效率呢？zui近，QIAGEN公司的研發(fā)專家發(fā)現(xiàn)，PCR引物5'端的堿基（也就是引物*個(gè)堿基）的不同，會(huì)影響PCR產(chǎn)物的克隆效率！以后設(shè)計(jì)引物可要注意了！看看QIAGEN的專家怎么說――

RalfPeist,DorotheeHosel,TheaTutjes,andDirkLoffert

基于UA的克隆技術(shù)廣泛應(yīng)用于PCR產(chǎn)物的快速、簡(jiǎn)便和的克隆。由TaqDNA聚合酶為PCR產(chǎn)物添加的多出來的一個(gè)A堿基能夠和pDriveCloningVector（QIAGENPCRCLoningKit提供）載體上的互補(bǔ)的U堿基配對(duì)結(jié)合。PCR產(chǎn)物能夠地結(jié)合到載體上，無需在引物中引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，無需酶切或者平端連接。

在某些特殊情況下，由于一些未知的原因，一些表面很正常的PCR產(chǎn)物的克隆效率卻很低。在這里，我們證實(shí)：PCR引物的5'末端堿基能夠顯著影響TaqDNA聚合酶添加A末端的效率――有的時(shí)候?qū)е轮挥幸恍〔糠諴CR產(chǎn)物帶有A末端，從而使PCR產(chǎn)物克隆效率明顯降低。在這里我們提供一些簡(jiǎn)單的建議如何提高這些“難克隆”的PCR產(chǎn)物的克隆效率。

材料和方法

GeneScan 分析以確定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)短

用QIAGEN公司的QIAprepSpinMiniprep提取質(zhì)粒pTZ19R。采用沒有校正功能的DNA聚合酶和特異性引物分別擴(kuò)增質(zhì)粒上的112bp、213bp和363bp片斷。每個(gè)片斷的擴(kuò)增都分別進(jìn)行4組反應(yīng)，采用同一個(gè)熒光標(biāo)記的正向引物（forwardprimer）和4個(gè)不同的反向引物之一進(jìn)行擴(kuò)增，4個(gè)reverseprimer的區(qū)別僅在于引物的5'端堿基分別為（A、T、G、C），其他序列都相同。PCR產(chǎn)物用ABIPRISM377測(cè)序儀分析，并用ABIGeneScan分析軟件進(jìn)行分析。

分析克隆效率

用DNeasyTissueKit和QIAampDNABloodMiniKit分別純化小鼠和人類基因組DNA。用QIAGENTaqDNA聚合酶或者HotStarTaqDNA聚合酶分別擴(kuò)增小鼠p53基因上一段500bp的片斷、人類prion蛋白基因上一段750 bp的片斷，以及人類白介素9基因上一段1000 bp的片斷。每個(gè)片斷的擴(kuò)增都分別進(jìn)行4個(gè)反應(yīng)，分別采用4對(duì)引物（區(qū)別僅在于5'末端堿基分別為A、T、G、C，其他序列相同，如表1）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物克隆到QIAGENPCR克隆試劑盒中的pDriveCloningVector中。計(jì)算克隆數(shù)，以其中一組5'端帶A堿基的克隆數(shù)為基準(zhǔn)（normalizedto）進(jìn)行比較,結(jié)果如圖。

表一：擴(kuò)增人白介素9基因中1kb的一段序列的引物組合：

PCRfragment Forwardprimer ReversePrimer

A 5'-ACTC.  .  .  TGC-3' 5'-ACGC.  .  .  TGT-3'

C 5'-CCTC.  .  .  TGC-3' 5'-CCGC.  .  .  TGT-3'

G 5'-GCTC.  .  .  TGC-3' 5'-GCGC.  .  .  TGT-3'

T 5'-TCTC.  .  .  TGC-3' 5'-TCGC.  .  .  TGT-3'

結(jié)果和討論

1.  引物的5'末端堿基對(duì)添加A末端反應(yīng)的影響

沒有校讀功能的DNA聚合酶如Taq酶，會(huì)在PCR產(chǎn)物的3'末端添加多一個(gè)A（即：比模版多加一個(gè)A）為了比較引物的5'末端堿基對(duì)添加A末端反應(yīng)的影響，我們比較了3個(gè)不同片斷的各4組PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)短。結(jié)果表明：引物5'末端是A堿基的，PCR產(chǎn)物末端添加A的效率zui高。引物5'末端是G的，PCR產(chǎn)物末端添加A的效率也很高，但是反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致添加2個(gè)A，從而影響后繼的PCR產(chǎn)物克隆。

2.  引物5'末端堿基對(duì)PCR產(chǎn)物克隆效率的影響，以及連接時(shí)間對(duì)克隆的影響

既然引物的5'末端堿基的不同會(huì)影響PCR產(chǎn)物末端添加A的反應(yīng)效率，我們也研究了這種現(xiàn)象對(duì)PCR產(chǎn)物克隆的影響。結(jié)果表明PCR產(chǎn)物克隆效率與添加單個(gè)A堿基的效率正相關(guān)，引物5'末端是A的PCR產(chǎn)物得到的重組陽性克?。╥nsert-bearingcolonies）zui高。不同長(zhǎng)短的片斷克隆結(jié)果都證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該盡可能在5'末端添加A堿基。

如果引物設(shè)計(jì)時(shí)5'末端無法加A，延長(zhǎng)連接時(shí)間能夠彌補(bǔ)克隆效率的不足。30分鐘的連接時(shí)間能夠保證引物末端帶A的PCR產(chǎn)物有足夠高的克隆效率。如果延長(zhǎng)連接時(shí)間到2小時(shí)，能夠顯著提高引物末端帶C的PCR產(chǎn)物克隆效率。

結(jié)論

1.  QIAGENPCRCloningKit能夠簡(jiǎn)單快速將PCR產(chǎn)物克隆到PCR載體中，采用QIAGEN試劑盒中特制的感受態(tài)細(xì)胞，只需要40分鐘可以完成從克隆到涂板的全過程。

2.  偶然，PCR產(chǎn)物克隆效率會(huì)意外的低，此時(shí)可以通過設(shè)計(jì)一對(duì)5'端帶A的引物（引物的*個(gè)堿基是A），這樣可以提高Taq酶在PCR產(chǎn)物末端添加A的效率，從而提高PCR產(chǎn)物在UA（TA）載體的克隆效率。

3.  如果不能在引物5'端加A，可以通過延長(zhǎng)連接時(shí)間來提高克隆效率。