小動物活體成像，是分子影像學(xué)的一種，主要通過生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)來進行。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進行標(biāo)記。
自從1999年，美國哈佛大學(xué)Weissleder等人提出了分子影像學(xué)（molecular imaging）的概念后，科學(xué)研究已不再局限于從肉眼觀察身體、生理和代謝過程在疾病狀態(tài)下的變化，而開始了解疾病的特異性分子事件。
與傳統(tǒng)的體外成像或細胞培養(yǎng)相比，分子映像學(xué)具有著顯著優(yōu)點。首先，能夠反映細胞或基因表達的空間和時間分布，第二，可以對同一個研究個體進行長時間反復(fù)跟蹤成像，提高了數(shù)據(jù)的可比性，又不需要殺死模式動物。第三，在藥物開發(fā)方面，為解決臨床藥物的安全問題提供了廣闊的空間，使藥物在臨床前研究中通過利用分子成像的方法，獲得更詳細的分子或基因水平的數(shù)據(jù)，為新藥研究的模式帶來了革命性的變革。
作為分子影像學(xué)的方法之一，小動物活體成像技術(shù)越來越廣泛地被應(yīng)用到了各個研究領(lǐng)域。這項技術(shù)主要就是利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。另外, 這一技術(shù)對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測靈敏度*，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。 因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點, 在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。
因此，獲得高質(zhì)量的生物熒光和熒光成像的圖片，對于進一步的實驗分析是至關(guān)重要的。而這一過程中，有許多因素影響成像的效果，那么究竟是哪些因素是zui關(guān)鍵的呢？北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司在多個實驗的基礎(chǔ)上，總結(jié)、分析，明確了如下幾個因素對活體成像結(jié)果起主要的影響作用：
一：CCD的性能
小動物活體成像系統(tǒng)主要包括以下幾部分，背部薄化CCD，密閉暗箱，麻醉系統(tǒng)以及軟件分析系統(tǒng)等。其中，CCD性能的好壞直接決定了圖像的質(zhì)量。而CCD的性能高低主要從以下幾個方面來考慮：分辨率、速度和強度。這三方面分別受不同的因子所限制，其中，分辨率主要取決于像素的多少和CCD尺寸的大??；速度主要與信噪比、靈敏度和讀出率有關(guān)；強度的參照指標(biāo)則為動態(tài)范圍，如下圖：

1 CCD的尺寸和像素的大小直接影響CCD成像的能力。
大像素點能夠增加靈敏度，像素面積越大，對光越靈敏，因為像素點面積有更多電子，能產(chǎn)生更多信號。如，高bin值拍攝時，采用的大像素點拍攝的方法，這樣能夠獲取更多的信號，拍攝到微弱的發(fā)光點； 然而，隨之而來的問題是，由于像素點的增大，其分辨率明顯下降，導(dǎo)致了圖像的清晰度差，甚至出現(xiàn)馬賽克現(xiàn)象。 
小像素點能夠增加分辨率，因此要提高影像質(zhì)量就必須增加CCD的像素，然而在CCD尺寸一定的情況下，增加了像素就意味著要縮小了像素中的光電二極管。而單位像素的面積越小，其感光性能越低，信噪比越低，動態(tài)范圍越窄，因此采用這種方法并不能無限制地增大分辨率，所以，如果不增加CCD面積而一味地提高分辨率，只會引起圖像質(zhì)量的惡化。但如果在增加CCD像素的同時想維持現(xiàn)有的圖像質(zhì)量，就必須在至少維持單位像素面積不減小的基礎(chǔ)上增大CCD的總面積。而目前更大尺寸CCD加工制造比較困難，成品率也比較低，因此成本也一直居高不下，這也就是Roper 公司提供的Lz 2048B價格較高的原因了（Lz 2048B的CCD尺寸為27.6 x 27.6mm）。

2 動態(tài)范圍的變化以bit值來表現(xiàn)，用來描述生成的圖像所能包含的顏色數(shù)，即灰階。深度是16位意味著圖像含有216種顏色深度的變化，這樣級別的CCD才能準(zhǔn)確表現(xiàn)所檢測到的熒光信號的微小差異，進而在圖像上表現(xiàn)出不同的深淺或色彩差異。

3 對于同樣級別的CCD芯片來講，信噪比的高低則對zui后的成像質(zhì)量更為關(guān)鍵，因為信噪比不僅與CCD本身有關(guān)，更與系統(tǒng)的整體配置和環(huán)境密切相關(guān)。
下面這個公式顯示了信噪比（SNR）的計算方法，

從中可以看到，QE值，讀出噪聲和暗噪聲是影響SNR的主要因素，單純強調(diào)任何一個方面都不具有實際意義。
Roper公司生產(chǎn)的CCD，其zui大的特色就是具有非常高的量子效率。與其它廠家的CCD相比，在500-700nm范圍內(nèi)，Roper CCD的量子效率為 〉90%，即使低于在400nm和高于700nm的范圍內(nèi)，量子效率也能夠達到40%以上，這樣為獲得高質(zhì)量的圖片提供了一個必要的條件。
溫度，一直以來也是研究人員所關(guān)注的重要影響因素之一，但事實上，在信噪比的計算中，只有暗電流是與溫度相關(guān)的。一般情況下，溫度越低，因溫度產(chǎn)生的暗噪聲也就越低；但是，當(dāng)溫度降低到一定程度時，亂真電荷（spurious charge）就會出現(xiàn)，從而增加了暗電流的值。因此，溫度對于CCD來講，并不是越低越好，而是有一個*值，即：既降低了溫度帶來的噪聲，又沒有引起亂真電荷的增加。Roper公司設(shè)計生產(chǎn)的1300B，采用液氮制冷，芯片溫度控制在-110℃，其原因正在于此，這是一個保證CCD工作狀態(tài)，且不會產(chǎn)生高噪聲的*溫度。

二：實驗所采用的細胞和基因的表達情況
對于活體成像實驗來講，許多實驗都涉及到了利用活細胞系來進行研究，而不同的細胞系，表達蛋白的能力也不同，因此實驗采用的細胞系的好壞，很大程度上影響了熒光成像的結(jié)果。 
重組基因或融合蛋白的表達情況同樣直接影響熒光的強弱，這個過程主要是由啟動子的強弱來控制的。如果實驗中采用了弱啟動子，那么在熒光檢測時，很可能會導(dǎo)致熒光弱很多倍，這樣，即使有表達的部位，也可能因此而無法檢測到，北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司的實驗結(jié)果證明了這一點。以下圖為例，A圖采用了強啟動子，在平板實驗中，20個細胞就可以在1*1 bin，60秒被檢測到，而B圖中所采用的弱啟動子，在8*8 bin，60秒時卻只能檢測到1250個細胞。

三：熒光素酶成像時，底物濃度和溫度的影響

哺乳動物生物發(fā)光，是將熒光素酶基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強度與標(biāo)記細胞的數(shù)目線性相關(guān)。
正因為熒光素酶成像是一種酶和底物的生化反應(yīng)，因此，生物熒光成像便不可避免地受到了底物濃度和動物體溫度的影響。在對動物進行底物注射時，底物濃度的高低和量的多少都會對成像的快慢和熒光的強弱造成影響。而活體成像系統(tǒng)的暗箱和檢測平臺都保持良好的恒溫狀態(tài)，也正是為了成像時能夠保證動物的體溫恒定在37℃。下面兩圖直觀地說明了底物濃度和溫度對于酶活性的影響：

綜上所述，在進行小動物活體成像時，必須綜合考慮各方面因素的作用，盡量將各個因素都保證在*狀態(tài)，才能得到真正高質(zhì)量的圖片。

然而，在活體成像過程，并不是總能保持各方面因素都達到*狀態(tài)，那么在這種情況下，應(yīng)該從哪些方面考慮，去獲得高質(zhì)量的圖片呢？北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司通過對一系列的實驗結(jié)果分析后，建議：
首先：構(gòu)建帶有強啟動子的融合表達蛋白。這是整個活體成像的*步，也是zui重要的一步。從上面的分析可以看出，啟動子的強弱對于zui終圖片的獲取影響甚大，強啟動子對熒光強度的提高，是任何只從CCD性能方面進行改進所*的。
另外，值得注意的是，在進行平板預(yù)實驗時，一定要將整個的實驗過程嚴(yán)格控制，包括細胞的個數(shù)，底物的濃度以及環(huán)境的溫度等。其中，環(huán)境溫度有時會被忽視，但真正的成像是在體內(nèi)進行的，如果平板實驗的溫度不準(zhǔn)確，不處于酶和底物作用的*溫度，那么就可能會導(dǎo)致獲得結(jié)果的不準(zhǔn)確性，造成下一步體內(nèi)注射細胞的偏差，影響實驗結(jié)果。下圖是不同溫度下，同樣的細胞系，同樣的個數(shù)獲得的結(jié)果，可以看到，在溫度降低后，能檢測到的細胞個數(shù)明顯減少。而這個結(jié)果實際上并不是CCD靈敏度發(fā)生了變化，而是環(huán)境溫度的原因。

第二：在所采用的細胞系無法更改或提高其表達蛋白的能力時，應(yīng)該考慮延長曝光時間。對于CCD成像來講，獲得的光子信號有一個累加效應(yīng)，因此，當(dāng)曝光時間增強時，微弱的光子信號得到了累加，從而可以被檢測到。
第三：曝光時間的延長，不僅增加了目的信號，對于噪音也存在一個累加效應(yīng)，為了避免這種情況，可以適當(dāng)?shù)脑黾觔in 值，即采用高大像素點進行拍攝，這樣獲得更多的光子信號，適用于微弱信號的拍攝。

總之，了解了小動物活體成像系統(tǒng)的原理，以及影響成像的一些相關(guān)因素后，能夠幫助研究人員更容易獲得高質(zhì)量的圖片，進而形成一篇好的科學(xué)論文。不過，儀器只是論文成功的助因，zui重要的決定因素還是在于文章是否具有創(chuàng)新性，以及文章整體內(nèi)容的豐富程度和含金量，希望我們的儀器能為科研工作者的文章增色許多。