諾博萊德 RIPA裂解液(弱) 樣本裂解采集

產(chǎn)品簡介：

多種成分均可從細胞中提取總蛋白，如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液(弱) (Weak RIPA Lysis Buffer )是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可用于PAGE電泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。

NobleRyder Weak RIPA Lysis Buffer主要由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

產(chǎn)品組成：

諾博萊德 RIPA裂解液(弱) 樣本裂解采集

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細胞

1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

2.去除貼壁細胞的培養(yǎng)液，用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

3.按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例， 加入Weak RIPA Lysis Buffer。移液器輕輕吹打，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于細胞1～3s內(nèi)，細胞就會被裂解。通常6孔板每孔細胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200～250μl。

4.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5.后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細胞

1.取Weak RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻后，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

2.低速離心懸浮細胞，棄上清，收集沉淀。

3.用手指輕彈細胞，使其松散。按照6孔板每孔細胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Weak RIPA Lysis Buffer 。通常6孔板每孔細胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。

4.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5.進行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)組織樣本

1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室溫溶解混勻后，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

2.把組zhi剪切成細小的碎片，越小越好。

3.取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

4.按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。

步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

5.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

6.進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項：

1.去除貼壁細胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

2.如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。

3.如果細胞量較多，必需分裝成50～100萬細胞/離心管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

4.如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

5.溶解NobleRyder RIPA Lysis Buffer時，應(yīng)盡量縮短溶解時間，避免有效成分失效。

6.裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-KB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

7.細胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或4℃進行。

有效期： 12個月有效。