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MesenPlify™ 干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基技術(shù)資料（第三期）
本期我們重點(diǎn)講一下MesenPlifyTM無(wú)血清無(wú)異種成分人類間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的使用指南，本篇中主要講解的是原代MSC分離培養(yǎng)，具體以臍帶組織塊法分離原代MSC操作為例。
原代MSC分離培養(yǎng)
步驟一 準(zhǔn)備材料
● 培養(yǎng)基：新鮮配置的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基（加1%雙抗）。
● 培養(yǎng)皿：準(zhǔn)備多個(gè)15cm皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
● 消毒劑：醫(yī)用消毒酒精（75%）。
● 洗滌液：生理鹽水（無(wú)菌，加 1%雙抗）。
● 工具盒：包括剪刀、鑷子、手術(shù)刀、移液器、離心管（50mL）等。
● 臍帶樣本：新鮮的臍帶泡在含有1%雙抗的PBS里4℃保存運(yùn)輸（最好在獲得后盡快處理）。
步驟二 消毒處理
01 吸棄臍帶保存液。
02 使用75%的醫(yī)用消毒酒精浸沒(méi)臍帶，浸泡2分鐘以確保消毒效果。
步驟三 清洗臍帶
01 用無(wú)菌生理鹽水清洗臍帶2-3次，確保去除殘留的臍血。
02 每次清洗后均應(yīng)用無(wú)菌的工具保持臍帶在無(wú)菌環(huán)境中。
步驟四 剪切處理
01 將臍帶剪成約2-3cm的小段。
02 用無(wú)菌生理鹽水再清洗2-3次，確保去除殘留的臍血。
步驟五 分離華通氏膠
01 沿靜脈剪開臍帶，盡量去除2條靜脈壁與1條動(dòng)脈壁。
02 輕輕分離華通氏膠，注意避免損傷表皮，使用彎頭手術(shù)剪將華通氏膠至2-3mm3大小的組織方塊，膠質(zhì)面向下，平鋪在150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，每皿10-12片方塊。
步驟六 細(xì)胞培養(yǎng)
01 由組織塊正上方緩慢滴加37℃復(fù)溫的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基，每個(gè)皿滴加15mL左右，注意不要讓組織塊飄起來(lái)。
02 放入37°C、5%CO?和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
步驟七 換液（注意：每2-3天換液一次）
01 每日觀察是否有細(xì)胞從組織塊爬出。
02 換液時(shí)，將培養(yǎng)瓶?jī)A斜，同時(shí)避免組織塊滑動(dòng)，小心吸棄上清液。
03 慢慢加入37℃復(fù)溫的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基，滴加培養(yǎng)基的手法與上述相同。
04 將細(xì)胞培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
05 正常換液培養(yǎng)，直到觀察到組織塊周圍有梭形細(xì)胞爬出時(shí)，使用滅菌后的鑷子夾除組織塊，此時(shí)如果再次換液，MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基的用量可改為為18-20mL/皿。
步驟八 傳代 （注意：在接種后第 12 天左右 ）
01 觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時(shí)，可進(jìn)行消化傳代。
02 傳代時(shí)細(xì)胞的接種密度為6000/cm2，請(qǐng)依據(jù)所需的細(xì)胞量，選擇合適大小的細(xì)胞培養(yǎng)皿。（具體操作步驟可參考下期“hMSCs的傳代培養(yǎng)"
注意事項(xiàng)：
所有操作都應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，避免任何非無(wú)菌材料的接觸。
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