一、永生化人角質(zhì)形成層細胞簡介：雖然原代人角質(zhì)形成層細胞更能真實地反映角質(zhì)形成層細胞在人體內(nèi)的生理狀態(tài)，但是一方面原代分離培養(yǎng)人角質(zhì)形成層細胞周期長及對技術(shù)人員經(jīng)驗要求較高，另一方面此原代細胞在體外的生長增殖能力非常緩慢有限，以至于此細胞不能多次傳代，這些不利因素制約了原代人角質(zhì)形成層細胞在實驗室的廣泛應(yīng)用
一、永生化人角質(zhì)形成層細胞簡介：
雖然原代人角質(zhì)形成層細胞更能真實地反映角質(zhì)形成層細胞在人體內(nèi)的生理狀態(tài)，但是一方面原代分離培養(yǎng)人角質(zhì)形成層細胞周期長及對技術(shù)人員經(jīng)驗要求較高，另一方面此原代細胞在體外的生長增殖能力非常緩慢有限，以至于此細胞不能多次傳代，這些不利因素制約了原代人角質(zhì)形成層細胞在實驗室的廣泛應(yīng)用。我公司的研究團隊擁有多年原代細胞分離培養(yǎng)及細胞永生化服務(wù)研究經(jīng)驗，成功建立了永生化人角質(zhì)形成層細胞。
表皮由兩大類細胞組成，即角質(zhì)形成層細胞和樹枝狀細胞。角質(zhì)形成層細胞最終產(chǎn)生角質(zhì)蛋白，在其向角質(zhì)細胞演變過程中，一般可以分為四層，即基底層、棘層、顆粒層以及角質(zhì)層。有人把前三層或前二層稱為生發(fā)層或馬爾匹基層。此外，在某些部位，特別在掌跖部位，角質(zhì)層下方還可見到透明層。
本公司生產(chǎn)的永生化人角質(zhì)形成層細胞采用酶解法和基因轉(zhuǎn)染制備而來，細胞總量約為1×106/T25方瓶，細胞純度可達90%以上，且不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。
二、 使用方法
1 、您收到細胞后，請按照以下方法進行操作：
取出 T25 方瓶， 75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入 37℃ , 5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中靜置 2-3 小時， 以穩(wěn)定細胞狀態(tài)，然后打開瓶子回收瓶子中培養(yǎng)液作為后續(xù)培養(yǎng)此細胞的培養(yǎng)液（備注： 先使用瓶子中培養(yǎng)液培養(yǎng)及盡快凍存保種細胞， 保存種子后再嘗試自己完全培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察是否適合此細胞生長，以免使用自己培養(yǎng)液不適合細胞生長造成細胞狀態(tài)不好或死亡） ，最后按照后面細胞傳代步驟進行細胞傳代培養(yǎng)。
2 、細胞傳代：
1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液， 用 PBS 清洗細胞 3 次；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察，待細胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm/min，離心 5min；
3）棄上清，沉淀細胞用 10ml 培養(yǎng)基重懸，然后按 1:2 比例進行分瓶傳代， 最后放入 37℃ ,5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待細胞貼壁后， 觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。
3 、細胞凍存：
1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細胞 3 次；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察，待細胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm/min，離心 5min；
3）用適當量的凍存液（培養(yǎng)液： FBS：DMSO=7:2:1）重懸細胞，并放置于凍存管中；
4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1h，然后將其移入-80℃過夜， 24h 后轉(zhuǎn)入液氮中進行長期儲存（或者按照梯度程序降溫模式直接放置-80 度凍存后并轉(zhuǎn)移液氮中長期儲存）。
4、細胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具） ，快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結(jié)晶，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁； 2）將凍存管中的細胞轉(zhuǎn)移至含 5ml 培養(yǎng)液無菌離心管中，1000rpm 離心 5min ，然后加入 5ml 完全培養(yǎng)液混勻細胞， 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至 T25 培養(yǎng)瓶中， 放置于 37℃ , 5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
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