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磺胺類藥物的檢測方法！
據(jù)美國食品藥品管理局消息，近日美國FDA更新進口預警措施(import alert)，其中，對我國8家企業(yè)的產(chǎn)品實施自動扣留，這8家企業(yè)的產(chǎn)品中，有2家都與磺胺類藥物殘留有關(guān)！
為什么水產(chǎn)品中會有磺胺類藥物？
磺胺類藥物(SAs，sulfonamides)屬于化學合成抗菌藥，具有抗菌譜廣、療效確定、方便安全的特點，是一類含有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)藥物的總稱。
磺胺藥曾廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，在控制魚病傳染和感染方面起了很大作用，解決了不少水產(chǎn)養(yǎng)殖中存在的問題。對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細菌性豎鱗病、爛鰓病、弧菌病、癤瘡、赤鰭病、腸炎、鞭毛蟲病有良好的防治效果。
但是由于廣泛應用也帶來了許多新問題，如毒性反應、二重感染、細菌產(chǎn)生耐藥性以及危害人體健康等不良后果，特別是在濫用的情況下更為嚴重。因此，各國普遍限制將此類藥物用于肉食動物，并提出了嚴格的限量要求。
聯(lián)合國食品法典委員會(CAC)和許多國家(包括中國)規(guī)定，水產(chǎn)品和飼料中磺胺類藥物殘留總量以及磺胺二甲基嘧啶的量不超過0.1mg/kg。
目前應用于磺胺藥物殘留的分析方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、ELISA法等。
為了使得該項檢測更加方便快捷、精密度高，中檢維康自主研發(fā)了《免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中16種磺胺殘留物》的檢測方法，該方法樣品前處理步驟簡單，雜質(zhì)干擾很小，檢測限低，并具有較好的回收率和精密度。
磺胺類藥物檢測方法
參考方法：
中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫局SN/T4057-2014《出口動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 免疫親和柱凈化-HPLC和LC-MS/MS法》
材料 —— 1、儀器
1、高效液相色譜儀
2、紫外檢測器
3、高速離心機
4、高速勻質(zhì)器
5、泵流操作架
6、C-18柱(美國clover公司)
材料 —— 2、試劑
1、磺胺類藥物標準品(中國獸藥監(jiān)察所)
2、Sepharose-4B(美國GE Healthcare)，
3、磺胺類藥物免疫親和柱(IAC-305北京中檢維康技術(shù)有限公司)
材料 —— 3、溶液的配置
1、pH7.4 PBS溶液：8.0 克NaCl + 2.90克Na2HPO4 12H2O + 0.24 克 KH2PO4 + 0.2克KCl 加990mL純水溶解，加純水至1升。
2、1.1%乙酸0.01M PBS溶液(%)：3.58 Na2HPO4+1.56 NaH2PO4，加970mL純水溶解，加11mL乙酸，加純水至1升。
3、16種磺胺類藥物儲備液：分別稱取5.0mg表1中的16種磺胺于50mL容量瓶中，用純甲醇定容至50mL；每種磺胺藥物的濃度為100ppm。
方法 —— 1、液相色譜條件
1、色譜柱：Cloversil-C18,4.6×250mm(5um)
2、流速：1.0mL/min
3、檢測器：紫外檢測器，波長270nm
4、進樣體積：50~100uL
方法 —— 2、樣品處理方法
1、準確稱取勻漿后樣品5.0 g，準確加入20.0mL 80%乙醇水溶液，高速勻質(zhì)2min后，搖床震蕩提取30 min，然后3000 RPM離心5min。
2、準確移取吸取上清液5.0 mL，用45.0mL純水稀釋并定容至50 mL，然后用玻璃微纖維濾紙過濾，收集濾液于干凈燒杯中。
3、將上述濾液20.0 mL(0.5g樣品)，以1滴/秒的流速全部通過磺胺類藥物免疫親和柱，直至空氣流經(jīng)親合柱，隨后用10.0mL純水以1-2滴/秒的流速淋洗親和柱，直至空氣流經(jīng)親合柱。
4、將玻璃小管置于親和柱下，用2.0 mL甲醇以1滴/秒淋洗親和柱，將所有樣品淋洗液收集于玻璃測試管中，50 °C下氮氣濃縮吹干后用流動相定容至0.5 mL，供HPLC分析。
方法 —— 3、添加回收試驗
對空白魚肉，蝦肉和蟹肉樣品進行添加回收實驗，分別添加20ug/kg、50ug/kg和100ug/kg三個濃度水平，每個濃度做5組平行實驗，計算回收率和變異系數(shù)
結(jié)果與分析 —— 1、HPLC方法的建立
色譜條件的選擇：
測定磺胺藥物的反相HPLC流動相體系主要有：乙酸銨-乙腈/甲醇，磷酸鹽緩沖液-乙腈/甲醇，乙酸-乙腈/甲醇等，經(jīng)反復對比試驗，本實驗選擇乙酸鹽溶液-甲醇流動相體系，SAs在較短的時間內(nèi)分離效果最好，且柱壓較低。
SAs屬兩性化合物，因此通過簡單地調(diào)節(jié)流動相的pH值能夠改善分離和控制SAs的保留時間。試驗表明，在pH6.5～2.5范圍內(nèi)，較低pH可明顯增加對SAs的分離能力(個別SAs順序可發(fā)生改變)，但保留時間延長。本試驗選擇1.1%乙酸0.01M PBS溶液-甲醇做流動相，并采取梯度洗脫的方式達到很好的效果，見圖1，為16種磺胺類藥物分別50ug/L的HPLC色譜圖。
圖1 16種磺胺類藥物分別50ug/L的HPLC色譜圖
結(jié)果與分析 —— 2、樣品添加回收率
魚肉，蝦肉和蟹肉樣品分別添加16種磺胺類藥物20ug/kg、50 ug/kg和100 ug/kg三個濃度水平回收率結(jié)果：樣品回收率在80%-106.5%之間，變異系數(shù)小于10%；
根據(jù)液相色譜靈敏度(10倍信噪比)和樣品提取方法計算，該方法樣品檢測靈敏度為20ug/kg。魚肉樣品添加20ug/kg 16種磺胺液相色譜檢測色譜圖見圖2。
魚肉樣品添加16種磺胺20ug/kg液相色譜檢測色譜圖
魚肉樣品中16種磺胺類藥物加標回收率和精密度(n=5)
蝦肉樣品中16種磺胺類藥物加標回收率和精密度(n=5)
蟹肉樣品中16種磺胺類藥物加標回收率和精密度(n=5)
