TUNEL細胞凋亡檢測服務(wù)實驗原理和方法原理：細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30%的染色體DNA在Ca2和Mg？依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180~200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的37-0H末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的37-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有37-OH形成，很少能夠被染色。

        細胞凋亡中染色體DNA 的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb 的大片段。然后大約30 %的染色體DNA 在Ca2+和 Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180~200bp核小體DNA多聚體。

　　DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的 3'-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法（TUNEL)。

　　由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA 的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation)，使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。

　　TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應(yīng)細胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋廣測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

2.包埋或者切片后，根據(jù)客戶所測指標，選取合適的一抗.二抗進行制片

3.（可選）根據(jù)上述所做好的切片進行拍片

4.（可選）針對做好的玻片進行分析，分析時選取較好的區(qū)域，分析三個視野

5.提供實驗報告：包括詳細的實驗方法及實驗結(jié)果的相關(guān)圖表

技術(shù)服務(wù)內(nèi)容

　　客戶須知

實驗周期

       TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素biotinylate標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結(jié)合，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應(yīng)，特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段.

TUNEL細胞凋亡檢測服務(wù)實驗方法

TUNEL 檢測對于貼壁細胞或細胞涂片

b.如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。

c.用4%多聚甲醛或碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液（P0098）固定細胞30-60分鐘。

d.用PBS或HBSS洗滌一次。

e.加入含0.1%TritonX-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。

f.轉(zhuǎn)步驟5。

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