ABIPrism7000型熒光定量PCR儀快速入門指南

一.開機(jī)

1.確認(rèn)電腦與主機(jī)的數(shù)據(jù)通訊線(灰色USB連線)連接正確。

2.確認(rèn)電腦處于外接電源供電狀態(tài)。

3.啟動電腦,以Administrator用戶名登錄,進(jìn)入Windows2000操作系統(tǒng)。

4.待桌面圖標(biāo)出現(xiàn)后,打開7000主機(jī)的電源。

5.待主機(jī)的電源指示燈點(diǎn)亮后,啟動7000SDS應(yīng)用軟件。

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前,請先檢查樣品加熱模塊以確定它沒有受到熒光污染,具體方法請按照第6節(jié)的“熒光污染的檢查與處理”流程進(jìn)行。

二.實(shí)時定量的軟件運(yùn)行

基因表達(dá)的定量和相對定量研究、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(GMO)、各種病原體的檢驗(yàn)檢疫等各種定量應(yīng)用;以CT值的大小作為樣品陰性、陽性判定依據(jù)的定性應(yīng)用;以及SNP檢測、等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)等的步PCR擴(kuò)增,都是采用實(shí)時定量模式,按照以下步驟操作。

1.新建文件菜單File→New,Assay選擇AbsoluteQuantification(實(shí)時定量模式),打開一個空白的96孔板文件。

2.探針設(shè)置雙擊任意一個孔,打開WellInspector窗口，該窗口也可從菜單View→WellInspector打開。

3.使用軟件,或探針(Detector)沒有設(shè)置好,請點(diǎn)擊AddDetector按鈕,打開DetectorManager窗口。該窗口也可以從菜單Tools→DetectorManager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針,點(diǎn)擊按鈕File→New,新建探針:設(shè)定探針的名稱(建議使用所研究基因符號,如GAPDH、ACTIN等)、報告基團(tuán)(FAM或者VIC)、淬滅基團(tuán)(TaqMan探針選TAMRA;MGB探針選None)、顏色(任意)等。設(shè)置完成后點(diǎn)擊OK,該探針即出現(xiàn)在探針列表中。重復(fù)此過程,設(shè)立其他的探針。

4.在DetectorManager窗口,從探針列表中點(diǎn)擊選擇所需探針,按住Ctrl鍵可以選擇多個探針,再點(diǎn)擊AddtoPlateDocument按鈕。后點(diǎn)擊Done關(guān)閉DetectorManager窗口。此時WellInspector窗口仍然是打開的。

5.填樣品表在96孔表中選定有樣品的一個或多個孔,在WellInspector頁面的SampleName欄中填入樣品名稱;在探針列表的Use項(xiàng)下的方框中,打鉤選擇要用的一個或多個探針;在Task欄中選擇樣品類領(lǐng):陰性對照選NTC;未知樣品選Unknown;標(biāo)準(zhǔn)品選Standard。對于Standard,還要在Quantity欄中輸入DNA拷貝數(shù)。注意:只有在這里輸入拷貝數(shù)后,軟件才能自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。建議標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在5點(diǎn)以上。建議每個樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)都按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求作一定數(shù)量的復(fù)管。

6.參比熒光如果使用的是ABI公司的定量PCR試劑,如TaqManUniversalPCR

MasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix等,參比熒光(PassiveReference)選ROX;如果使用的試劑中不含有參比熒光,請選None。完成后點(diǎn)擊右上角的X按鈕,關(guān)閉WellInspector窗口。

7.循環(huán)參數(shù)切換到Instrument頁面,設(shè)定及修改PCR熱循環(huán)程序:在ABI公司默認(rèn)的程序中,50°C2min是UNG酶起作用的步驟,UNG酶可以預(yù)防其他PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物(其中以U代替T)對定量PCR的污染;95°C10min的作用是激活Taq酶,同時滅活UNG酶;40個循環(huán)的95°C15sec和60°C1min是定量PCR的循環(huán)步驟。7000默認(rèn)在后一步,也就是60°C1min復(fù)性和延伸時收集熒光信號。如果使用ABI公司的定量PCR試劑,上述參數(shù)不需要調(diào)整,直接運(yùn)行PCR循環(huán)就可以了。在使用其他廠家試劑的情況下,如果其中沒有UNG酶,請刪除50°C2min步驟;如果使用的不是Taq酶而是其他普通的Taq酶,請刪除95°C10min步驟。

8.循環(huán)參數(shù)的修改方法刪除:按住Shift鍵并在相應(yīng)的Stage或Step中點(diǎn)擊,該步驟9.其他設(shè)置反應(yīng)體積:定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積是50μL;如果想修改的話,建被選中變黑,按Del鍵即可刪該步驟或循環(huán)。插入:在需要插入?yún)?shù)的位置點(diǎn)擊,出現(xiàn)粗黑豎線后,分別點(diǎn)擊AddHold、AddCycle或AddStep按鈕添加保溫、循環(huán)或循環(huán)中的一個步驟。修改溫度和時間:拖動鼠標(biāo),選中需要修改的溫度或時間數(shù)字,輸入新的數(shù)值即可。議大于25μL。融解曲線試驗(yàn):在DissociationProtocol選項(xiàng)左邊的方框中打鉤,儀器即在定量PCR循環(huán)完成后繼續(xù)做融解曲線試驗(yàn)。如果是用SYBRGreenI染料方法進(jìn)行定量研究,建議進(jìn)行融解曲線試驗(yàn),以判定PCR反應(yīng)特異與否。單峰表示單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,多峰表示PCR擴(kuò)增有雜帶。注意:只有SYBRGreenI染料方法才需要進(jìn)行融解曲線試驗(yàn),TaqMan探針和MGB探針法都不需要。9600Emulation:選中此項(xiàng),即可使7000的升降溫速度減慢,與9600和7700一樣,從而可以直接使用在9600、7700型PCR儀上優(yōu)化好的循環(huán)條件,而不需任何修改。

10.啟動擴(kuò)增點(diǎn)Save按鈕保存文件設(shè)置。確認(rèn)96孔板或全部樣品管在主機(jī)內(nèi)放置妥當(dāng)后,點(diǎn)擊Start按鈕,開始PCR循環(huán)。屏幕上動態(tài)顯示PCR進(jìn)程和剩余時間。

11.監(jiān)控進(jìn)程切換到Results頁面的AmpPlot子頁面,可以實(shí)時顯示PCR曲線隨著循環(huán)增加而逐步增長的實(shí)際情況。如果Detector選FAM或VIC,只顯示對應(yīng)探針的變化情況;如果選All,則同時顯示所有探針的反應(yīng)進(jìn)程。

12.保存結(jié)果程序結(jié)束后,點(diǎn)Disconnect按鈕,然后File→Save保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以保存為.sds格式,也可以保存為.sdt格式,作為以后同類實(shí)驗(yàn)的模板,節(jié)省軟件設(shè)置時間。

三.實(shí)時定量的數(shù)據(jù)分析

1.數(shù)據(jù)分析切換到Result頁面,進(jìn)入擴(kuò)增曲線(AmplificationPlot)子頁面,查看軟件已經(jīng)自動分析好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。注意:此時的數(shù)據(jù)是軟件根據(jù)默認(rèn)值(基線起點(diǎn)為3,終點(diǎn)為15)得到的初步結(jié)果,還需要根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的具體情況,精細(xì)調(diào)節(jié)Baseline(基線)的起止點(diǎn)后,重新分析,以得到更的數(shù)據(jù)。

2.基線的起點(diǎn)和終點(diǎn)確定原則基線(Baseline)是指PCR開始時信號很低、接近背景且比較平穩(wěn)的那個階段。起點(diǎn)要避開開始幾個循環(huán)由于高溫導(dǎo)致的信號增高,設(shè)在信號已經(jīng)降到背景高度且能維持平穩(wěn)的地方,一般在3到6個循環(huán)之間;終點(diǎn)要避免覆蓋信號已經(jīng)開始有明顯增長的地方,一般在本組數(shù)據(jù)中小的CT值前再3個循環(huán)處。另外,起點(diǎn)與終點(diǎn)之間能間隔8個循環(huán)以上,以滿足統(tǒng)計(jì)基線標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)學(xué)要求。調(diào)整好起止點(diǎn)以后,再點(diǎn)擊Analyze按鈕,軟件即自動計(jì)算新的閾值和CT值,并更新實(shí)驗(yàn)報告。注意:此時擴(kuò)增曲線頁面上顯示的閾值數(shù)字并不更新,但是這不影響后臺數(shù)據(jù)運(yùn)算的準(zhǔn)確。

3.線性圖譜在默認(rèn)的設(shè)置中,PCR擴(kuò)增曲線圖譜的縱坐標(biāo)代表經(jīng)過ROX和空白校正后的相對熒光信號強(qiáng)度,橫坐標(biāo)代表PCR循環(huán)次數(shù)(從1到40);縱坐標(biāo)以對數(shù)表示,橫坐標(biāo)以線性表示。如果要看*線性的S形圖譜,請雙擊縱坐標(biāo)軸線,打開坐標(biāo)設(shè)置窗口,將縱坐標(biāo)改成線性形式。

4.原始數(shù)據(jù)切換到Component子頁面,察看原始數(shù)據(jù)。正常的FAM信號強(qiáng)度,基線時約為5000點(diǎn),擴(kuò)增完成達(dá)到約28000點(diǎn),中間呈S形增長;TAMRA和ROX的信號開始時都比FAM的基線要稍低一點(diǎn),TAMRA信號到指數(shù)增長階段會降低,而ROX信號是水平穩(wěn)定的,不隨PCR進(jìn)程而改變,因?yàn)镽OX是以固定濃度加入到PCR試劑中的,它本身并不參與PCR擴(kuò)增。

5.原始數(shù)據(jù)切換到Spectra子頁面,也可以察看原始數(shù)據(jù)。Spectra與Component這兩個頁面的區(qū)別是:Component顯示的是信號強(qiáng)度隨時間(即PCR循環(huán)次數(shù))的變化,是縱向的;而Spectra顯示的是每個PCR循環(huán)點(diǎn)上信號強(qiáng)度在不同波長上的分布,也就是在4個濾色片上的分布,是橫向的。

6.標(biāo)準(zhǔn)曲線切換到StandardCurve子頁面,察看標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意:只有在Setup時輸入標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)后,軟件才能自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7.實(shí)驗(yàn)報告切換到Report子頁面,察看實(shí)驗(yàn)報告。確認(rèn)無誤后,保存結(jié)果。也可以從File菜單中選擇Export,再選擇數(shù)據(jù)類型,輸出各種類型的數(shù)據(jù),包括CT值、相對信號強(qiáng)度、原始數(shù)據(jù)、融解曲線數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。輸出的數(shù)據(jù)可以用Excel打開,并可在Excel中重新生成擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線等圖譜。

四.終點(diǎn)讀板的軟件運(yùn)行

各種等位基因鑒定實(shí)驗(yàn),包括SNP檢測、基因突變檢測等,都包括兩個階段:1、PCR擴(kuò)增;2、擴(kuò)增后的熒光信號讀取(Post-read)和數(shù)據(jù)處理。步既可以在9700、9600等普通的PCR儀上進(jìn)行,也可以在7000、7900等定量PCR儀上進(jìn)行;第二步必須在定量PCR儀上進(jìn)行。以下只敘述第二步Post-Read和數(shù)據(jù)處理的操作方法。如果步也在定量PCR儀上進(jìn)行,請按第三節(jié)實(shí)時定量的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)置和運(yùn)行軟件;待PCR完成、數(shù)據(jù)保存好后,再將同一塊板放在7000上,按以下步驟操作。

1.新建文件菜單File→New,Assay選擇AllelicDiscrimination(終點(diǎn)讀板模式,用于SNP分析等),新建一個空白96孔板文件。

2.探針設(shè)置雙擊任意一個孔,打開WellInspector窗口。該窗口也可以從菜單View→WellInspector打開。

3.使用軟件,或者M(jìn)arker沒有設(shè)置好,先點(diǎn)擊AddDetector按鈕,打開DetectorManager窗口。該窗口也可以從菜單Tools→DetectorManager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針,File→New,新建探針,設(shè)定探針的名稱(建議使用等位基因的名稱,如Allele1、Allele2等)、報告基團(tuán)(FAM或者VIC)、淬滅基團(tuán)(TaqMan探針選TAMRA;MGB探針選None)、顏色(任意)等。設(shè)置完成后點(diǎn)擊OK,該探針即出現(xiàn)在探針列表中。

4.位點(diǎn)設(shè)置Detector設(shè)置好后,點(diǎn)擊AddMarker按鈕,打開MarkerManager窗口。該窗口也可以從菜單Tools→MarkerManager打開。如果在Marker列表中找不到合適的探針,點(diǎn)CreateMarker,取名(建議使用位點(diǎn)的名稱,如D2S1356等),OK,新位點(diǎn)的名字即出現(xiàn)在左邊的位點(diǎn)列表中,選中位點(diǎn),在右邊的探針列表中打鉤選擇與該位點(diǎn)配套的探針,一般FAM、VIC各一個組成一套。

5.選擇位點(diǎn)Marker設(shè)置完成后,在左邊的位點(diǎn)列表中選中該Marker,點(diǎn)擊CopytoPlateDocument按鈕,該Marker的信息即分成3行出現(xiàn)在WellInspector窗口中。重復(fù)選好全部所需Marker,再點(diǎn)擊Done關(guān)閉MarkerManager窗口。注意:定量PCR實(shí)驗(yàn)只要求設(shè)置探針(Detector)即可,而SNP實(shí)驗(yàn)既要設(shè)置探針(Detector),還要設(shè)置位點(diǎn)(Marker)。如果沒有設(shè)置Marker,軟件將不能進(jìn)行基因分型。

6.填樣品表在96孔表中選定有同類樣品的一個或多個孔,在WellInspector頁面asterctor窗口。的Marker列表的Use項(xiàng)下的方框中打鉤,選擇要用的Marker,然后在探針的Task欄選擇樣品類型:陰性對照選NTC;未知樣品選Unknown。沒有Std。

7.參比熒光如果用的是ABI公司的PCR試劑,如TaqManUniversalPCRMMixwithorwithoutUNG,參比熒光(PassiveReference)選ROX;如果所用試劑中不含ROX參比熒光,請選None。點(diǎn)擊右上角的X按鈕關(guān)閉WellInspe。

8.循環(huán)參數(shù)切換到Instrument頁面。PCR熱循環(huán)程序只有60°C一個步驟,不需要修改。設(shè)置反應(yīng)體積。SNP的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積是50μL。點(diǎn)Save按鈕保存文件設(shè)置。

9.終點(diǎn)讀板確認(rèn)96孔板或全部樣品管在主機(jī)內(nèi)放置妥當(dāng)后,點(diǎn)擊Post-read按鈕,nect按鈕,然后File→Save保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

10.保存結(jié)果程序結(jié)束后點(diǎn)Discon

五.終點(diǎn)讀板的數(shù)據(jù)分析

Allelicdiscrimination子頁面,在Marker下拉菜單X軸的是VIC信號,中選面看實(shí)驗(yàn)報告。確認(rèn)無誤后,保存分析結(jié)果。也可以開始讀取數(shù)據(jù),大約10秒完成。

1.數(shù)據(jù)分析切換到Results頁面中選擇要查看其數(shù)據(jù)的Marker,在下面96孔板界面中按Excel方式選擇需要查看的樣品孔,軟件即在中間的圖譜上顯示信號的分布情況。選擇不同的Marker,顯示不同的信號。可以點(diǎn)擊放大或縮小工具調(diào)整圖譜的大小。

2.信號分布正常的信號應(yīng)該分為4組,靠近原點(diǎn)處為NTC;靠近是純合子,其正常信號強(qiáng)度范圍在2-8之間;靠近Y軸的是FAM信號,是另一種純合子,其正常信號強(qiáng)度范圍在4-16之間;靠近對角線位置的樣品中既有FAM信號也有VIC信號,是雜合子,強(qiáng)度為FAM和VIC各自的一半左右。

3.基因分型點(diǎn)擊套索工具,然后通過鼠標(biāo)圈定NTC信號,在Call下拉菜單NTC,這些數(shù)據(jù)點(diǎn)即被分型為NTC并顯示相應(yīng)的顏色和圖標(biāo);同樣分型FAM純合子、VIC純合子和雜合子。

4.保存結(jié)果切換到Report頁從File菜單中選擇Export,再選擇數(shù)據(jù)類型,輸出各種類型的數(shù)據(jù)。

六.日常維護(hù)

1.熒光污染的檢查與處理新建一個空的96孔板,菜單Instrument→Calibrate打開ROIInspector窗口,將ExposureTime調(diào)到4096,選定FilterB,點(diǎn)擊Snapshot按鈕(不要動下面兩個按鈕,以免ROI設(shè)置出錯),此時可以看到排列整齊的96孔圖像。如果觀察到特別明亮的光斑,則表明該孔存在熒光污染。將光標(biāo)移動到單個孔的上方可在右側(cè)欄中的PixelIntensity處讀出該孔的熒光信號值,超過500以上的需要清洗。清洗時盡量使用較細(xì)且無硬物突出的干棉簽擦拭;如果未能去除,可用去離子水清洗;如污垢頑固,可使用90%乙醇清洗,但要等乙醇*揮發(fā)干凈后方可蓋上熱蓋,以免有機(jī)溶劑損傷熱蓋上的透鏡組。

2.檢測器光源的更換流程關(guān)機(jī)冷卻約15分鐘后,打開儀器頂部蓋板,擰松燈泡保護(hù)罩的螺釘,取下保護(hù)罩,將燈泡拆下,更換新的燈泡并插好連線。注意:備用的新燈泡必須保存在干燥環(huán)境中。