本課題組在《Theranostics》上發(fā)表了一篇題為“Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging”的研究論文，采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化（AFADESI）技術(shù)和基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡（ANN）的虛擬校正-定量質(zhì)譜成像（VC-QMSI）方法，建立了針對紫杉醇及其衍生物前藥的體內(nèi)定量成像方法，為評估該類藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)異質(zhì)性分布提供了直觀有效的途徑，也為靶向抗腫瘤新藥研發(fā)提供了有力的研究工具。

    可區(qū)分正常組織和腫瘤組織的靶向抗腫瘤藥物開發(fā)是癌癥治療研究中的關鍵問題。在新藥研發(fā)的早期，如何快速評估抗癌藥物的腫瘤靶向性非常重要，且了解藥物在腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性分布更具挑戰(zhàn)。開發(fā)一種高精度、高靈敏度的定量成像分析方法有望解決這一難題。質(zhì)譜成像是一種無需標記的分子成像技術(shù)，它可提供有關生物體內(nèi)藥物和代謝物分布的時空信息，其在藥物開發(fā)領域的應用正在迅速增加。紫杉醇具有很強的抗腫瘤活性，但直接用藥常伴隨有骨髓抑制、神經(jīng)毒性等嚴重不良反應；近年來臨床致力于對紫杉醇進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化、劑型改造或前體藥物開發(fā)，以提高藥物的腫瘤靶向能力，減少副作用。本研究建立了紫杉醇及其衍生物前藥的體內(nèi)定量成像方法，評估了該類藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)異質(zhì)性分布。

   通過構(gòu)建含已知濃度藥物的模擬生物組織，建立了定量質(zhì)譜成像標準曲線；采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像（AFADESI-MSI）技術(shù)，同時采集藥物、藥物代謝物和內(nèi)源性代謝物信息；以內(nèi)源性代謝物為內(nèi)標，結(jié)合ANN方法，構(gòu)建了生物組織中質(zhì)譜響應基體效應自動預測與校正的回歸模型，對動物切片的單位像素進行逐一定量，從而建立了整體動物體內(nèi)藥物質(zhì)譜成像分析方法。將該方法用于評估靜脈注射紫杉醇（PTX）、紫杉醇脂質(zhì)體（PTX-liposome）和紫杉醇前藥（PTX-R）在A549細胞異種移植裸鼠中的靶向效率和瘤內(nèi)的分布異質(zhì)性。

圖1 VC-QMSI策略在整體動物組織中準確定位抗腫瘤藥物的過程示意圖 （A）基于內(nèi)源性代謝物的機器學習方法預測相對校正因子的示意圖 （B）不同器官的相對校正因子成像以及相對校正因子預測值和實測值的比較；縮寫：H心臟，Li肝臟，Sp脾，Lu肺，K腎，Br大腦，M肌肉，Tu腫瘤 （C）以藥物含量-未校正的藥物響應強度構(gòu)成的標準曲線和以藥物含量-校正后的藥物響應強度構(gòu)成的虛擬校正標準曲線對比 （D）通過使用K均值和t-SNE聚類分析進行自動像素標記的整體動物分割圖像 （E）整體動物體內(nèi)藥物定量的可視化結(jié)果以及光學圖像

2 噴霧溶劑選擇

    考察了多種有機溶劑/水組合以及揮發(fā)性鹽對藥物響應值的影響，終優(yōu)選出乙腈：水（5:5）作為更佳噴霧溶劑。它能對藥物及內(nèi)源性代謝物進行有效的解吸、提取以及離子化，達到靈敏準確的定量結(jié)果。

圖2 三個給藥組在不同時間點的AFADESI-MSI可視圖（A）PTX在整體動物體內(nèi)的時空和定量分布（B）PTX在腫瘤組織中的時空和定量分布

4 PTX-R的瘤內(nèi)異質(zhì)分布

    腫瘤根據(jù)形態(tài)學的異質(zhì)性可分為不同的微區(qū)（圖3A，3B）。基于代謝物特征采用t-SNE和k-means等手段得到的腫瘤微區(qū)自動識別的結(jié)果（圖3C）與H＆E染色結(jié)果（圖3A）高度一致。PTX-R在腫瘤壞死區(qū)域和膠原蛋白區(qū)域的含量明顯高于腫瘤薄壁組織區(qū)域（圖3D，3E, 3F），表明PTX-R具有出色的腫瘤穿透能力。對比腫瘤的薄壁組織和間質(zhì)區(qū)域，PTX-R更多地積累于腫瘤中未明顯分化的區(qū)域，比如腫瘤的膠原蛋白區(qū)域和脂肪組織。這種藥物在腫瘤微區(qū)分布的異質(zhì)性值得進一步研究，它對于認識腫瘤的生長、侵襲、對藥物的敏感性以及預后均有重要作用。

圖3 PTX-R在瘤內(nèi)的異質(zhì)分布（A）腫瘤組織的H＆E染色圖像（B）放大倍數(shù)（×20）的代表性腫瘤微區(qū)（C）基于代謝物譜的腫瘤微區(qū)的t-SNE空間分布（D）PTX-R在腫瘤微區(qū)中的分布（E）藥物離子成像和H＆E染色成像之間的耦合匹配疊加圖（F）腫瘤微區(qū)中PTX-R的定量分布

    采用無需標記的AFADESI和VC-QMSI技術(shù)成功建立了針對紫杉醇及其前藥的定量質(zhì)譜成像方法，評估了該類抗腫瘤藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)分布異質(zhì)性，并提供了直觀的實驗證據(jù)表明設計的紫杉醇前藥具備優(yōu)異的腫瘤蓄積能力和低全身毒性。進一步證明AFADESI-MSI技術(shù)具有高靈敏和寬覆蓋的特點，可在整體動物的體內(nèi)微區(qū)同時可視化各種類型的藥物、代謝物和內(nèi)源性代謝物。VC-QMSI方法將內(nèi)源性代謝物作為內(nèi)標，建立ANN模型；根據(jù)模型預測每個像素的RCF值，并校正藥物離子強度，從而實現(xiàn)藥物在整體動物和亞器官組織中的定量可視化。紫杉醇前藥及其代謝物的體內(nèi)定量分布研究有助于從藥物的保留、消除、靶向和釋放四個角度設計有效的腫瘤靶向藥物。所建方法有助于預測與藥物分布相關的藥效和安全性，在抗腫瘤藥物研發(fā)早期進行直接快速的藥效篩查，減少損耗、降低成本。此外，本研究對闡明藥物的功效、毒性和耐藥性提供了一個深入的視角，有助于抗腫瘤藥物的設計和優(yōu)化。

Jin Zhang, et al. (2020). “Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging.” Theranostics 10(6): 2621-2630.