植物受激發(fā)后發(fā)出的熒光主要有:藍綠熒光( Blue-green fluorescence,BGF ) 、紅 熒 光 ( Red-fluorescence,RF) 和遠紅熒光( Far-red fluorescence,F(xiàn)RF) ,如圖3所示。
圖1波長 355 nm 激光激發(fā)的熒光光譜
經(jīng)光照射后,植物的不同組織會吸收不同波段的光,因此植物能在不同波段發(fā)射出熒光,如圖2。激發(fā)光主要有以4個波段: 藍(波長435-480 nm),被類胡蘿卜素和葉綠素吸收,并釋放出較高量子效率,可以激發(fā)葉片表皮及更深處組織的葉綠素熒光;紅光(波長 640-780 nm),只能被葉綠素吸收,因而相比藍光還能被類胡蘿卜素吸收,該波段光的吸收范圍較窄,能激發(fā)遠紅波段的葉綠素熒光;綠光(波長 500 ~ 560 nm),被葉綠素吸收,但是吸收量很小,因而相比藍、紅光,綠光可以到達葉片的深度最大,能激發(fā)葉綠素熒光;紫外光(280 ~315 nm)既能激發(fā)葉綠素熒光,還能激發(fā)短波熒光。
圖2葉面截圖
利用葉綠素熒光可以對植物的生長狀況和各類營養(yǎng)元素缺乏癥狀進行鑒別。Subhash 等利用波長355 nm 的氙氣燈作為激發(fā)光源,采集了煙草葉片4個波段( 中心波長分別為 440、520、690 和 740 nm)的熒光,分析了各波段的熒光比率對煙草葉片衰老情況的鑒別能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著葉片的衰老,在各熒光比率中,葉綠素熒光比率( F 690 /F 740) 有明顯上升,說明葉綠素熒光可以作為檢測植物光合作用強弱的一項指標。Langsdorf等采用最大波長為340 nm的氙氣燈激發(fā)甜菜葉片,獲取相同4個波段的熒光圖像及熒光比率圖像,經(jīng)偽彩色處理后,通過觀察圖像發(fā)現(xiàn),短波熒光( F440和F520) 在葉脈部位強度較高,葉綠素熒光( F690和 F740) 在葉脈間隔部位強度較高,使用F440 /F690和F440 /F740這兩個熒光比率能區(qū)分葉片含氮量的高低。Cadet等對向日葵正常葉片和分別缺乏氮、磷、鉀的葉片進行實驗后發(fā)現(xiàn),缺磷葉片的紅熒光和遠紅熒光強度比值( FRF /FFRF) 有明顯下;缺鉀葉片的藍綠熒光強度有明顯上升,并且從藍綠熒光圖像中可知:葉片的缺鉀癥狀局限在葉尖和葉邊緣部位。Benediktyová 等發(fā)現(xiàn)大量的紫外光子都被葉片表皮吸收,難以到達葉細胞更深處,激發(fā)的葉綠素熒光十分微弱。因此采用最大波長為455 nm的藍色LED燈激發(fā)煙草健康葉片和病害葉片的葉綠素熒光,通過葉綠素熒光的三維重建圖,將葉片結(jié)構(gòu)可視化,對不同深度的葉細胞進行偽彩色處理,通過觀察圖像發(fā)現(xiàn),受病害浸染的細胞深度位于健康細胞下方約25μm處。Pereira 等采用波長473 nm 的激光激發(fā)柑橘黃龍病葉片,提取熒光圖像的10個顏色描述符對葉片感染黃龍病的過程進行跟蹤。結(jié)果發(fā)現(xiàn),綠色描述符的范圍、均值和標準差等值在染病到發(fā)病的整個階段都有明顯變化。Pereira 等認為該方法可實現(xiàn)植物病害的無損檢測,檢測過程無需樣品預處理,具有檢測早期( 染病后1個月) 患黃龍病柑橘葉片的潛力。Sankaran等選取兩個品種的柑橘葉片,分別在實驗室條件和自然環(huán)境進行實驗,用4種LED燈( 紫外、紅、綠、藍) 照射葉片,每個LED燈能激發(fā) 3個波段熒光(黃、紅、遠紅) ,總共提取了病害葉片的12個熒光特征和10個熒光比率特征,基于這22 個特征分別用兩種分類方法對病害葉片和健康葉片進行了鑒別。結(jié)果表明,貝葉斯分類法在實驗室條件下的分類準確率高于85% ,而采用決策樹分類器的計算時間是前者的10多倍,但是后者在實驗室條件和自然環(huán)境都具有更好的識別能力,分類準確率高于94%。此外,在22個特征中,由紫外激發(fā)的黃色熒光( YF_UV) 和由綠光激發(fā)的熒光比率(SFR_G) 能區(qū)分柑橘黃龍病葉片和缺氮葉片。
利用熒光成像技術監(jiān)測作物生長及病害研究,國內(nèi)學者也做了大量的研究,如楊昊諭等用中心波長為473 nm和660 nm的激光,分別在4 種激光強度下激發(fā)黃瓜活體葉片熒光。通過對比實驗,確定最佳激發(fā)光源為強度7.5 W、波長473 nm,并在此激發(fā)條件下,建立葉片熒光參數(shù)F732 /F 685與葉片葉綠素含量的線性回歸模型。陳兵等研究了黃萎病對棉花葉片的葉綠素熒光特性的影響,通過對熒光參數(shù)的分析可以發(fā)現(xiàn),隨著病害程度增加,棉花葉片的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量均減少,而類胡蘿卜素含量先降后增。結(jié)果表明,病害程度與葉綠素熒光參數(shù)的相關性較好。隋媛媛等采集健康、染病3 d和6 d的黃瓜霜霉病葉片的熒光光譜,用一階導數(shù)、主成分分析處理光譜數(shù)據(jù)后,基于最小二乘支持向量機對前10個主成分進行分類和預測,結(jié)果表明,使用徑向基核函數(shù)的支持向量機方法對黃瓜霜霉病害的分類預測能力達到了97. 73%。張石銳等以水稻葉片為研究對象,采集了水稻葉片在波長450 nm的LED燈照射條件下的葉綠素熒光光譜,同時測量了水稻生長區(qū)土壤的濕度,建立了基于 Lorentzian 方程的土壤含水量和葉綠素熒光強度的回歸模型,結(jié)果表明,該模型的決定系數(shù)達到0. 99,該方法可以用于土壤水分的檢測
圖3 不同波段下的熒光圖像
圖4 不同氮肥處理下不同波段的熒光圖像及熒光比值圖像
圖5 473 nm激光激發(fā)熒光光譜及熒光光譜參數(shù) F732/F685與葉綠素含量關系
圖6 葉綠素熒光光譜及強度與葉片水分利用效率關系
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