小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型

缺血再灌注損傷，即缺血器官、組織重新獲得血液供應(yīng)，不僅不能使組織、器官功能恢復(fù)，反而加重了功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞。對(duì)麻醉動(dòng)物的肝中葉和肝左葉的門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈進(jìn)行阻斷和再通，由于肝臟中葉和左葉血流的阻斷和再通，引起肝臟中葉和左葉明顯的再灌注損傷。肝臟缺血過(guò)程中由于肝細(xì)胞內(nèi)ATP迅速耗盡，導(dǎo)致乳酸酮體等的堆積，及線粒體氧化磷酸化功能低下，引發(fā)代謝性酸中毒，缺血過(guò)程中細(xì)胞缺氧使ATP含量下降，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)外Ca2 +重新分布，即Ca2 +內(nèi)流，引起線粒體的損傷。再灌注過(guò)程中由于氧自由基的爆發(fā)性增多，中性粒細(xì)胞的聚集，kupffer細(xì)胞的激活，細(xì)胞凋亡及其他多種細(xì)胞因子的作用，使得肝細(xì)胞膜損傷，內(nèi)皮細(xì)胞損傷及肝臟微循環(huán)障礙等導(dǎo)致肝臟功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞。

    1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Balb/C小鼠，雄性，周齡為4w~6w，體重為20g~22g。

2.實(shí)驗(yàn)分組：

    實(shí)驗(yàn)分六組：正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、受試藥組三個(gè)劑量組，每組15只動(dòng)物。

3.實(shí)驗(yàn)周期

    0h、3h、6h、12h、24h、72h

    4.建模方法

1 小鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

2 3%戊巴比妥鈉80mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后將小鼠平躺在手術(shù)臺(tái)上膠帶固定四肢，將小鼠腹部術(shù)去毛，用碘酒和75％乙醇術(shù)區(qū)消毒。

3 取腹正中切口25px，打開(kāi)腹腔，小心分離出肝臟左、中葉之肝蒂（左、中葉肝臟供血的門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈）。

4 用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈，使約70%的肝臟缺血，以防止發(fā)生嚴(yán)重腸系膜靜脈淤血。0.5min后，與非阻斷的右葉相比，肉眼可見(jiàn)阻斷葉明顯變白，說(shuō)明阻斷成功，用止血鉗夾閉皮膚切口臨時(shí)關(guān)閉腹腔，同時(shí)將小鼠放在37℃恒溫加熱墊上保溫。

5 完成持續(xù)缺血60min后，重新打開(kāi)腹腔，迅速取出血管夾，恢復(fù)缺血肝血流，0.5min左右可見(jiàn)缺血區(qū)肝臟由白色逐漸恢復(fù)為鮮紅色表明再灌注成功，逐層縫合腹腔肌肉和皮膚關(guān)閉腹腔，完成手術(shù)。待小鼠清醒后放回飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，密切關(guān)注小鼠的狀態(tài)及生存狀況并做好記錄。

6 術(shù)后分別于再灌注0h、3h、6h、12h、24h及72h麻醉小鼠，摘眼球取血，室溫靜置2h后于4℃3000r離心10分鐘提取血清，放入-80冰箱凍存。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）的水平。同時(shí)統(tǒng)一取肝左葉組織1．125px×25px×0．50px留作病理標(biāo)本或分生標(biāo)本。

  5.模型評(píng)價(jià)

1 分別檢測(cè)術(shù)后0h、3h、6h、12h、24h及72h小鼠血清中ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）的水平。

2 統(tǒng)一取肝左葉組織1．125px×25px×0．50px于4%多聚甲醛溶液中固定24h后脫水，包埋，進(jìn)行石蠟切片后行HE染色，tunel染色。作壞死評(píng)分。肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，網(wǎng)狀纖維支架塌陷，肝細(xì)胞壞死，空泡變樣，肝細(xì)胞索、肝竇充血腫脹，邊界不清，周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

肝臟缺血損傷評(píng)分：

0分：無(wú)肝細(xì)胞損傷

1分：輕度損傷，特點(diǎn)為細(xì)胞質(zhì)空泡化，病灶核固縮

2分：中度損傷，血竇膨脹，細(xì)胞溶質(zhì)空泡化，細(xì)胞邊界模糊

3分：中度到重度損傷，凝固性壞死，大量血竇膨脹，紅細(xì)胞滲出到肝鎖，嗜伊紅細(xì)胞增多，中性白細(xì)胞著邊（附著于血管壁）

4分：嚴(yán)重壞死，失去肝臟結(jié)構(gòu)，肝索崩解，出血，嗜中性粒細(xì)胞滲入 

3 細(xì)胞因子的檢測(cè)

肝臟損傷后，血清中TNFα、IFNγ、IL-2、IL-6、ICAM1等細(xì)胞因子的表達(dá)顯著升高，可以用ELISA 法檢測(cè)。

6 注意事項(xiàng)

6.1 分離肝門(mén)時(shí)用棉簽分離，可避免對(duì)肝臟的損傷

6.2術(shù)前禁食有利于手術(shù)進(jìn)行

6.3阻斷血流要一次成功，否則會(huì)造成缺血預(yù)處理，減輕損傷程度

6.4取材時(shí)鑷子不要損傷肝臟