細胞培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用讓我們對生命的奧秘有了更深一步的理解，同時也為醫(yī)學(xué)研究和臨床治療提供了重要支持。無論是研究者還是醫(yī)生，對細胞培養(yǎng)技術(shù)的掌握都是至關(guān)重要的，它們將開啟更多關(guān)于生命的精彩探索之旅。讓我們一起走進細胞的微觀世界，探尋其中的無限可能吧！

01 細胞復(fù)蘇和傳代 

1.1細胞復(fù)蘇

將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移入15ml離心管中，加入8ml預(yù)熱的1640wan全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，1000rpmX5min，棄上清液。加入8ml 1640培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml 1640wan全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于T25培養(yǎng)瓶中，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細胞傳代

細胞密度達到80%左右時去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗1-2次。加入0.7-1ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，用力拍打瓶壁，間隔 5-10s放到顯微鏡下觀察，50-70%的細胞脫落后，加入 2ml 以上wan全培養(yǎng)基中止消化；然后分瓶，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

02. 細胞凍存 

細胞密度達到80%～90%時，去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次加入0.7-1ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，用力拍打瓶壁，間隔 5-10s放到顯微鏡下觀察，50-70%的細胞脫落后，加入 2ml 以上wan全培養(yǎng)基中止消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，1000rpmX5min，棄上清液。加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)，立即放入一80℃冰箱內(nèi)，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放入液氮中，可以保存三個月。

凍存液的配制：90%血清+10%DMSO ;DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

03.細胞培養(yǎng)注意事項 

（1）進入細胞間開始細胞培養(yǎng)時，必須嚴格按照下列步驟操作：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用。

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

③確定酒精燈內(nèi)的酒精量，需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）后在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區(qū)域清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺面。

（2）細胞污染的預(yù)防

①實驗用品防止污染。細胞培養(yǎng)所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要chedi，各種溶液滅菌要仔細，并在無菌實驗檢測陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。

②操作過程防止污染。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進入細胞間。

④實驗開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全柜之外的物品，必須及時對手套進行消毒。

⑤進入細胞培養(yǎng)間后關(guān)好門，坐下來盡量少走動以免影響生物安全柜的風(fēng)簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大規(guī)模污染。

⑥細胞操作時動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口放在火焰周圍簡單轉(zhuǎn)動燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。

⑦實驗操作時生物安全柜的隔板要盡可能放低，盡量減少談話，打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區(qū)，以免造成不必要的污染。

⑧瓶蓋應(yīng)當(dāng)?shù)狗旁谶h離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。

⑨不要從敞開的容器口上方經(jīng)過，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的污染。

⑩實驗操作時要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實驗完畢應(yīng)及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺面。

（3）防止細胞交叉污染

①在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分，最好作上標(biāo)記便于辨別。按順序進行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進行時易發(fā)生混亂。

②在進行換液或傳代操作時，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細胞。

③所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，必須及時保種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。