產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff Clone^® Plus One Step Cloning Kit是一款簡(jiǎn)便、快速、高效的DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的*一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應(yīng)20 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡?yáng)性率可達(dá)95%以上。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品應(yīng)用

快速克隆；定向克??；定點(diǎn)突變。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

2）本產(chǎn)品僅作科研用途！

實(shí)驗(yàn)流程    

圖1. Hieff Clone^® 一步法快速克隆試劑盒實(shí)驗(yàn)流程圖。

一. 制備線性化載體

選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對(duì)載體進(jìn)行線性化。建議盡量選擇無(wú)重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。載體克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴(kuò)增獲得。

1.酶切制備線性化載體
1）雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。
2）單酶切線性化：線性化程度較差。可適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間以降低轉(zhuǎn)化背景。
注：不含插入片段的假陽(yáng)性克隆是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽(yáng)性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。

2.反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體

建議使用高保真聚合酶（如：Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）進(jìn)行載體擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR擴(kuò)增模板應(yīng)盡量使用預(yù)線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對(duì)克隆陽(yáng)性率的影響。

Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系兼容幾乎所有酶切反應(yīng)體系和常規(guī)PCR反應(yīng)體系，當(dāng)載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高時(shí)，可以無(wú)需純化，直接進(jìn)行重組反應(yīng)。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)線性化載體進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。

二. PCR擴(kuò)增制備插入片段

1.設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物

Hieff Clone® 引物設(shè)計(jì)方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點(diǎn)）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的*一致的序列。

插入片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+基因特異性正向擴(kuò)增引物序列—3’

插入片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
3’—基因特異性反向擴(kuò)增引物序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’

【注】：
①基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
②上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。推薦使用用翌圣無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動(dòng)生成插入片段的擴(kuò)增引物。若手動(dòng)設(shè)計(jì)，可參照以下實(shí)例。

1）如載體選用雙酶切線性化（Hind III + EcoR I）：

2）如載體選用單酶切線性化（BamH I）：

3）如載體選用反向PCR擴(kuò)增制備：

圖2. 插入片段引物設(shè)計(jì)方案

【注】：最終引物長(zhǎng)度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進(jìn)行引物合成。計(jì)算擴(kuò)增引物退火溫度時(shí)，只需計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計(jì)算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。

2.插入片段PCR擴(kuò)增

插入片段擴(kuò)增可用任意PCR酶擴(kuò)增，無(wú)需考慮產(chǎn)物末端有無(wú)A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會(huì)出現(xiàn))。但為了減少擴(kuò)增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增（Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone™重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如果擴(kuò)增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴(kuò)增產(chǎn)物可以無(wú)需純化，直接用于重組反應(yīng)。但PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較低時(shí)，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。

三. 線性化載體與插入片段濃度測(cè)定

推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對(duì)DNA進(jìn)行定量。將線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物做數(shù)個(gè)等體積稀釋梯度，原始產(chǎn)物和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA Marker）比較條帶亮度以確定其近似濃度。

四. 重組反應(yīng)

1. 線性化載體與插入片段使用量計(jì)算

Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系最適載體使用量為0.03 pmol；最適載體與插入片段摩爾比為1:2-1:3，即最適插入片段使用量為0.06-0.09 pmol。這些摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得：

最適載體使用量 = [0.02×載體堿基對(duì)數(shù)]ng (0.03 pmol)

最適插入片段使用量 = [0.04×插入片段堿基對(duì)數(shù)]ng (0.06 pmol) 或= [0.06×插入片段堿基對(duì)數(shù)]ng (0.09 pmol)

例如，將長(zhǎng)度為2 kb的插入片段克隆至長(zhǎng)度為5 kb的載體時(shí)，載體的最適使用量應(yīng)為：0.02 × 5000 = 100 ng；插入片段最適使用量應(yīng)為：0.04 × 2000 = 80 ng或0.06 × 2000=120 ng。
注：
1）當(dāng)插入片段長(zhǎng)度大于載體時(shí)，最適載體與插入片段使用量的計(jì)算方式應(yīng)互換，即插入片段當(dāng)做載體，載體當(dāng)做插入片段進(jìn)行計(jì)算。
2）線性化載體的使用量應(yīng)在50-200 ng之間；插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量應(yīng)在20-200 ng之間。當(dāng)使用上述公式計(jì)算最適使用量超出這個(gè)范圍時(shí)，則選擇低或高使用量即可。
3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。

2.反應(yīng)體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）

注：
1）X和Y分別是根據(jù)公式計(jì)算得到線性化載體和插入片段用量。

2）陰性對(duì)照-1可用來(lái)確認(rèn)線性化載體有無(wú)環(huán)狀質(zhì)粒殘留，可選擇性進(jìn)行。
3）當(dāng)插入片段擴(kuò)增模板是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，可用陰性對(duì)照-2來(lái)確認(rèn)有無(wú)環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留，可選擇性進(jìn)行。

4）試劑盒中提供陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)所需組分，可用來(lái)排除其他實(shí)驗(yàn)材料及操作因素的影響，可選擇性進(jìn)行。

3.重組反應(yīng)

1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
2）置于50℃反應(yīng)20 min。當(dāng)插入片段＞5 kb時(shí)，可將孵育溫度延長(zhǎng)至25 min。
注：建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進(jìn)行反應(yīng)。

3）待反應(yīng)完成后，建議將反應(yīng)管置于冰上冷卻5 min，以防溫度過高降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。

4）反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。

五. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板

1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat No. 11802ES）。

2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。

3）42℃熱激90秒，冰浴孵育2 min。

4）加入900 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復(fù)蘇。37℃，200 rpm，搖菌45 min。
5）5000 rpm離心3 min，棄掉900 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無(wú)菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

六. 克隆鑒定

方便快捷的方法是菌落PCR。用無(wú)菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測(cè)序引物進(jìn)行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽(yáng)性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測(cè)序鑒定。

應(yīng)用實(shí)例

                             
圖3：Hieff Clone^® Plus One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長(zhǎng)度的單片段基因。

A-D：重組轉(zhuǎn)化平板。E：插入片段和載體濃度檢測(cè)電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb，載體與插入片段摩爾比：1:3，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。

常見問答

1、最佳克隆位點(diǎn)選擇？
答：在選擇克隆位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)避免選擇克隆位點(diǎn)上下游50 bp內(nèi)有重復(fù)序列的區(qū)域。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)時(shí)，重組效率將達(dá)到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會(huì)受到較大影響。

2、無(wú)克隆長(zhǎng)出或克隆數(shù)較少？

答：出現(xiàn)該情況，建議同時(shí)使用試劑盒所附帶的陽(yáng)性對(duì)照，可排除試劑盒本身的影響，并進(jìn)行進(jìn)一步判定，主要有以下可能情況：

1）引物設(shè)計(jì)不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點(diǎn)+基因特異性擴(kuò)增引物】，GC含量40% - 60%。

2）感受態(tài)細(xì)胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細(xì)胞，確保其轉(zhuǎn)化效率>107 cfu/μg。每次操作時(shí)可設(shè)置一組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。選擇克隆感受態(tài)細(xì)胞(如DH5α)，不能選擇表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞。

3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量不足/過量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應(yīng)體系。

4）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物不純，抑制反應(yīng)：線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。建議線性化載體、插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH2O中。

3、出現(xiàn)較多假陽(yáng)性

答：主要有以下可能情況：

1）載體線性化不*：即使是痕量未*酶切的載體也會(huì)產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)化背景?？赏ㄟ^陰性對(duì)照檢測(cè)載體是否線性化*，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長(zhǎng)酶切反應(yīng)時(shí)間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

2）插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物：建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。

3）反應(yīng)體系中混入了相同抗性的質(zhì)粒：PCR擴(kuò)增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，若擴(kuò)增產(chǎn)物直接用于重組反應(yīng)，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板會(huì)產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化背景。建議使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DpnI消化或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

4、菌落PCR無(wú)條帶

答：主要有以下可能情況：

1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。

2）PCR體系或程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質(zhì)粒條帶，建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證；或者進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

3）重組失?。?/span>沒有目的條帶，只有空質(zhì)粒的條帶，說明重組不成功，載體線性化不*，建議優(yōu)化酶切體系。

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