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分選技術(shù)新突破：純度與得率的全面提升
Q
為什么CytoFLEX SRT分選能夠達(dá)到這么高的純度與得率？?jī)x器這么小的體積，分選細(xì)胞的得率卻比以前的‘大塊頭’明顯高很多，我感覺(jué)以前分選準(zhǔn)備那么多細(xì)胞好浪費(fèi)。
這是許多體驗(yàn)過(guò)CytoFLEX SRT的用戶的共同疑問(wèn)。今天，讓我們揭開(kāi)CytoFLEX SRT優(yōu)質(zhì)分選性能背后的秘密，了解它如何通過(guò)雙域精準(zhǔn)DCD計(jì)算實(shí)現(xiàn)分選純度和得率的全面提升。
分選液滴延遲（Drop Charge Delay，DCD）的重要性
在細(xì)胞分選過(guò)程中，分選液滴延遲（drop charge delay，DCD）有時(shí)也被簡(jiǎn)寫為（drop delay，DD），是指從被檢測(cè)顆粒通過(guò)激光檢測(cè)點(diǎn)，到形成分選液滴斷裂點(diǎn)（break off point，BOP）并施加電荷之間的時(shí)間延遲，這一時(shí)間延遲通常以“cycle（周期）"為單位表示。這是因?yàn)橐旱蔚男纬墒怯煞诌x振蕩頻率與振幅共同決定，液滴形成的過(guò)程被分為若干周期或循環(huán)（cycle）。在BOP處，液滴開(kāi)始與液流斷開(kāi)，帶著相應(yīng)的電荷，經(jīng)過(guò)電場(chǎng)偏轉(zhuǎn)進(jìn)入收集管中。DCD的準(zhǔn)確性對(duì)于確保目標(biāo)顆粒被正確地偏轉(zhuǎn)到收集容器中至關(guān)重要。若DCD設(shè)置不準(zhǔn)確，目標(biāo)顆?？赡軙?huì)被錯(cuò)誤地分類為廢液，導(dǎo)致分選回收率和純度下降。
Rmax全面的分選質(zhì)控
Rmax（maximum expected recovery）是一種用于評(píng)估細(xì)胞分選儀性能的系統(tǒng)方法，通過(guò)計(jì)算樣本在未分選部分中損失的目標(biāo)細(xì)胞百分比，來(lái)確定分選回收率的最大值。與僅依賴純度的評(píng)估方法相比，Rmax提供了更全面的分選性能評(píng)估，特別是在分選效率和回收率至關(guān)重要時(shí)。
一般的分選后質(zhì)控，會(huì)將分選細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)單的回測(cè)，檢測(cè)純度，但實(shí)際上會(huì)忽略掉分選得率。分選得率相較于分選純度，更容易受分選液滴延遲的影響。
傳統(tǒng)技術(shù)的局限
傳統(tǒng)的分選液滴延遲只是機(jī)械地使用微球進(jìn)行簡(jiǎn)單估算，估計(jì)出大致的DCD分布區(qū)間，最終確認(rèn)可能的最佳值。但是由于分選過(guò)程涉及細(xì)胞在不同域中的流體動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，從流動(dòng)室內(nèi)到接近噴嘴，再到噴嘴通過(guò)，這些都會(huì)影響DCD的準(zhǔn)確性。
在流動(dòng)室內(nèi)，鞘液形成的流體動(dòng)力學(xué)聚焦過(guò)程中，細(xì)胞距離中心軸的位置不同，其流體速度也不同?？拷室毫鞯募?xì)胞加速較慢，而位于中心軸的細(xì)胞加速較快。通過(guò)噴嘴后，由于動(dòng)量守恒，速度方程又會(huì)變化。
因此，有些儀器雖然能夠通過(guò)微球自動(dòng)估算出DCD的值，但卻與Rmax的最佳解存在較大誤差。例如，Rmax方法獲得的最佳DCD，得率可以達(dá)到90%，但自動(dòng)計(jì)算獲得的DCD雖然對(duì)純度沒(méi)有影響，卻導(dǎo)致得率下降。
創(chuàng)新的雙域精準(zhǔn)DCD計(jì)算方法
CytoFLEX SRT采用了一種創(chuàng)新的雙域精準(zhǔn)DCD計(jì)算方法，結(jié)合了時(shí)間域測(cè)量和空間域分析，確保了計(jì)算的精確性和可靠性。
時(shí)間域測(cè)量（DD1）
首先，CytoFLEX SRT通過(guò)測(cè)量QC微球從激光觸發(fā)點(diǎn)到專用激光點(diǎn)的行進(jìn)時(shí)間來(lái)計(jì)算DD1。QC微球是標(biāo)準(zhǔn)化的校準(zhǔn)顆粒，能夠提供一致且可重復(fù)的測(cè)量結(jié)果。這一步驟確保了初始測(cè)量的高精度和可靠性。
空間域分析計(jì)算（DD2）
接下來(lái)，CytoFLEX SRT基于高精度圖像分析，通過(guò)高速攝像技術(shù)捕捉液體射流在BOP處的斷裂和形成液滴的過(guò)程。通過(guò)分析這些圖像，能夠精確計(jì)算從QC微球經(jīng)過(guò)專用激光點(diǎn)到BOP的剩余時(shí)間。高精度圖像分析能夠捕捉到微小的時(shí)間變化和液體射流的動(dòng)態(tài)變化，確保了更高的時(shí)間測(cè)量精度。
雙域精準(zhǔn)DCD計(jì)算的優(yōu)勢(shì)
1
提高分選精度和回收率
通過(guò)雙域精準(zhǔn)DCD計(jì)算，CytoFLEX SRT確保分選儀在最佳條件下運(yùn)行，從而大幅提高了分選的回收率和精度。準(zhǔn)確的DCD設(shè)置，使得目標(biāo)顆粒能夠被更有效地偏轉(zhuǎn)到收集容器中，減少了樣品浪費(fèi)。
2
實(shí)時(shí)監(jiān)控和調(diào)整
圖像分析提供了實(shí)時(shí)反饋，允許在分選過(guò)程中動(dòng)態(tài)調(diào)整DCD。即使在樣品條件變化或儀器狀態(tài)波動(dòng)時(shí)，也能確保分選儀始終在最佳狀態(tài)下運(yùn)行，進(jìn)一步減少誤差。
3
減少實(shí)驗(yàn)誤差
自動(dòng)化的雙域精準(zhǔn)方法減少了環(huán)境與樣本等因素的干擾，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的操作步驟和自動(dòng)化計(jì)算，保證了測(cè)量結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。
結(jié)語(yǔ)
通過(guò)采用創(chuàng)新的雙域精準(zhǔn)DCD計(jì)算方法，CytoFLEX SRT不僅在分選純度和得率方面取得了顯著突破，還實(shí)現(xiàn)了分選過(guò)程的自動(dòng)化與智能化，讓流式分選變得竟然如此簡(jiǎn)單。2024年CytoFLEX家族迎來(lái)十周年，我們持續(xù)為科研人員提供更加高效和可靠的工具。未來(lái)，我們期待更多用戶能夠體驗(yàn)到CytoFLEX SRT帶來(lái)的優(yōu)質(zhì)性能和便利，加速科研前沿的探索。
參考資料
1.PEREZ‐GONZALEZ, Alexis, et al. Evaluation of Sort Recovery via Rmax. Current Protocols, 2024, 4.2: e986.
2."Method and apparatus for compensating for variations in particle trajectories in electrostatic sorter for flowcell cytometer" (控制液滴可控充電并與載運(yùn)流體斷開(kāi)的時(shí)間點(diǎn)的的方法以及細(xì)胞儀系統(tǒng)) -編號(hào): CN101675334B,持有人: 貝克曼庫(kù)爾特公司 (Beckman Coulter, Inc.)
3."Flow Cytometer Sorter" - 編號(hào): US8889072B2,持有人: Beckman Coulter, Inc.