什么是細胞凍存?
細胞長勢良好,供大于求時,就可以考慮把細胞凍存起來,以后再用。當溫度低于-70℃時,細胞內的酶活性全部停止,代謝活動停止,故可以達到長期保存的目的。隨著溫度降低,細胞內外的水分都會結晶,所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞,從而引起細胞死亡,特別是-20-0℃的階段,冰晶呈針狀,及容易引發(fā)細胞損傷。
細胞凍存盒的基本原則是緩慢冷凍,實驗證明這樣可以大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑,這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外,減少細胞內冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。
細胞凍存盒的實驗步驟:
1.配制含10%DMSO、20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液4mL。
2.取出生長良好的細胞。
3.吸除舊的培養(yǎng)液:拿出吸管(要拿吸管的上端),插入與抽濾瓶相連的橡膠管中,在酒精燈外焰灼燒滅菌,細胞培養(yǎng)瓶傾斜將吸管插入瓶底部一角,吸出舊的培養(yǎng)液,將用后的吸管棄于廢棄缸里。
4.消化:拿出5mL移液管,插入電槍中,酒精燈過火灼燒,吸取2mL0.25%胰酶,混勻,放于37℃孵箱中消化5-6min。取下用后的移液管。
5.中和:從孵箱中拿出培養(yǎng)瓶,顯微鏡下觀察細胞是否被*消化下來,5mL滅菌后移液管加入3mL培養(yǎng)液終止消化。
6.離心收集細胞:配平后離心200×g,3min。將新培養(yǎng)液加入新培養(yǎng)瓶中,2mL/瓶(培養(yǎng)瓶底面積為25cm2)。
7.分裝凍存:將細胞分裝入凍存管中,每管1mL。
8.在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;
9.凍存:細胞凍存盒,里面有異丙醇,直接放入-80過夜,凍存盒自動緩慢降溫。然后-196℃液氮保存。
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