三聯(lián)外置泵微生物限度檢測(cè)儀CYW-300S

微生物的檢測(cè)，無論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義，本文對(duì)生長量測(cè)定法、微生物計(jì)數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測(cè)簡要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標(biāo)的二十余種常用的檢測(cè)方法，簡要介紹了這些方法的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。
　　一個(gè)微生物細(xì)胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并按自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量，體積，大?。┚筒粩嘣黾?，于是出現(xiàn)了個(gè)體的生長現(xiàn)象。如果這是一種平衡生長，即各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L時(shí)，則達(dá)到程度后就會(huì)發(fā)生繁殖，從而引起個(gè)體數(shù)目的增加，這時(shí)，原有的個(gè)體已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)群體。隨著群體中各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長，就引起了這一群體的生長，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標(biāo)來衡量。微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個(gè)體生長在科研上有困難，通常情況下也沒有實(shí)際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長通常指群體的擴(kuò)增。微生物的生長繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映。因此生長繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問題的重要指標(biāo)，同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或是對(duì)致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長抑制緊密相關(guān)。所以有必要介紹一下微生物生長情況的檢測(cè)方法。既然生長意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測(cè)定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)，而測(cè)定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標(biāo)來進(jìn)行衡量。
　　1. 微生物計(jì)量法
　　1.1 體積測(cè)量法
　　又稱測(cè)菌絲濃度法，通過測(cè)定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取量的待測(cè)培養(yǎng)液（如10 mL）放在有刻度的離心管中，設(shè)定的離心時(shí)間（如5 min）和轉(zhuǎn)速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測(cè)出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有偏差。
　　稱干重法
　　可用離心或過濾法測(cè)定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1~5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40 ℃下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。
　　1.3 比濁法
　　微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測(cè)定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測(cè)。如使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計(jì)，在波長600 nm處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.coli的生長及誘導(dǎo)時(shí)間。
　　1.4 菌絲長度測(cè)量法
　　對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測(cè)定時(shí)間內(nèi)菌絲生長的長度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長長度，借此衡量絲狀微生物的生長。
　　2. 微生物計(jì)數(shù)法三聯(lián)外置泵微生物限度檢測(cè)儀CYW-300S
　　2.1 血球計(jì)數(shù)板法
　　血球計(jì)數(shù)板是一種有結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1 mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。
　　2.2 染色計(jì)數(shù)法
　　為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧梢愿奖愕脑陲@微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。
　　2.3 比例計(jì)數(shù)法
　　將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.4 液體稀釋法
　　對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù)，從適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查大或然數(shù)表MPN（Most Probable Number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測(cè)，例如飲用水和牛奶的微生物。
　　2.5 平板菌落計(jì)數(shù)法
　　這是一種常用的活菌計(jì)數(shù)法。將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9 cm的平板上出現(xiàn)50~500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。
　　2.6 試劑紙
　　在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。
　　2.7 膜過濾法
　　用特殊的濾膜過濾體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。
　　3. 間接測(cè)定法
　　微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長測(cè)定的相對(duì)值。因此可利用生理指標(biāo)等間接參數(shù)來測(cè)定生物量。
　　3.1 測(cè)定含氮量
　　大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測(cè)定粗蛋白的含量。含氮量的測(cè)定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法。Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)?，收集在呼吸?jì)中，用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量。
　　3.2 測(cè)定含碳量
　　將少量（干重0.2~2.0 mg）生物材料混入1 mL水或無機(jī)緩沖液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　還原糖測(cè)定法
　　還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測(cè)。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。
　　3.4 氨基氮的測(cè)定
　　離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02 mol/L的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02 mol/L的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。
　　3.5 其他生理物質(zhì)的測(cè)定
　　P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長量的測(cè)定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長。如在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細(xì)菌的長勢(shì)。
　　4. 商業(yè)化快速微生物檢測(cè)法
　　微生物的檢測(cè)，其發(fā)展方向是快速，準(zhǔn)確，簡便，自動(dòng)化，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測(cè)原理，結(jié)合不同的檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測(cè)儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如：
　　4.1 試劑盒，培養(yǎng)基等手段
　　抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測(cè)技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測(cè)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如：抗干擾微生物培養(yǎng)基，新型生化鑒定管，微生物計(jì)數(shù)卡，環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)試劑盒等，可方便的用于多項(xiàng)檢測(cè)。
　　4.2 借助新型儀器
　　BACTOMETER全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)可以數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測(cè)結(jié)果，樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù)，對(duì)酵母和霉菌檢測(cè)同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（Impedance Technology）將待測(cè)樣本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi)，底部有一對(duì)不銹鋼電極，測(cè)定因微生物生長而產(chǎn)生阻抗改變。如微生物生長時(shí)可將培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子，電阻抗法可測(cè)試這種微弱變化，從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測(cè)微生物的存在及數(shù)量。測(cè)定項(xiàng)目包括總生菌數(shù)，酵母菌，大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，等。
　　微生物OD值是反映菌體生長狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，OD是Optical Density（光密度）的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物測(cè)定的范圍，需要紫外分光光度計(jì)測(cè)大吸收波長。用得多的是：505 nm測(cè)菌絲菌體、560 nm測(cè)酵母、600 nm測(cè)細(xì)菌。用測(cè)OD方法畫微生物生長曲線時(shí)，同一株菌的起始培養(yǎng)濃度可以準(zhǔn)備多管（根據(jù)檢測(cè)點(diǎn)的需要，如需檢測(cè)10個(gè)點(diǎn)，就準(zhǔn)備10管），然后每個(gè)點(diǎn)取一管出來測(cè)OD值就行了。
　　一般測(cè)菌體密度的OD的波長范圍是580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌用600 nm，已經(jīng)屬于可見光區(qū)（200 nm～400 nm為紫外光區(qū)，400 nm～800 nm為可見光區(qū)）?？瞻兹缬盟觯枰x心洗滌菌體；空白如用不接種的培養(yǎng)基做就不需要洗滌，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)以求條件一致，后注意一般OD值在控制在0.1~0.4好，在這個(gè)區(qū)內(nèi)的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀釋后再測(cè)，因?yàn)镺D太大，分光光度計(jì)的靈敏度就會(huì)顯著降低。
　　一般都測(cè)吸光值，而且好是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，保持發(fā)酵液或菌體的稀釋倍數(shù)一致，吸光值與稀釋倍數(shù)不成正比，可保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)有可比性。且取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)好。
　　另，用分光光度計(jì)測(cè)微生物的OD值為什么要把波長設(shè)為600 nm
　　這個(gè)波長其實(shí)只是針對(duì)濁度，而分光光度計(jì)在600 nm處對(duì)濁度的反應(yīng)比較靈敏。測(cè)吸收峰的實(shí)際意義并不大，比如LB搖瓶培養(yǎng)過夜的大腸桿菌，其實(shí)在400多納米處的吸收大，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰。