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上海北諾生物科技有限公司
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質(zhì)粒抽提過程中內(nèi)毒素如何去除?2022/05/28
內(nèi)毒素,即脂多糖或LPS,是革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)細胞膜的組成部分。細菌外膜的外層脂質(zhì)部分是*由內(nèi)毒素分子所構(gòu)成的。單個大腸桿菌細胞約包含兩百萬個LPS分子,每個LPS分子由疏水的脂質(zhì)A(lipidA)部分、復(fù)雜的糖類殘基陣列部分及負電性的磷酸基團所組成。因此,每個內(nèi)毒素分子都具有疏水域、親水域和電荷域,這使它在與其他分子相互作用時具有其*的自身性質(zhì)。細菌在其活性生長期向其周圍微環(huán)境中散布少量的內(nèi)毒素,在死亡時則釋放大量內(nèi)毒素。在質(zhì)粒制備的細菌細胞裂解過程中,內(nèi)毒素分子被從外膜釋放到溶菌液中
原代培養(yǎng)經(jīng)驗分享2017/08/02
經(jīng)驗分享:1.原代細胞鋪満瓶底后棄原液,PBS沖洗2次。2.加入0.25%Trypsin-0.02%EDTA,量覆蓋瓶底即可,室溫作用,鏡下觀察至組織塊周圍的細胞回縮,立體感增強。3.棄去消化液,PBS輕漂一遍(目的是除去EDTA,它對脆弱的原代細胞很不好)但不要用力搖晃,以免部分消化稍過的細胞流失。4.加入培養(yǎng)液吹打,不要產(chǎn)生氣泡,對細胞有損。5.吸出2/3的懸液傳入新瓶。6.向原瓶中余下的1/3細胞懸液中補加2/3的新培養(yǎng)液,與未消化的組織塊繼續(xù)培養(yǎng)。7.24小時內(nèi)新的細胞又從組織塊中爬出啦
體外細胞的原代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇,傳代培養(yǎng)2017/08/02
三、實驗結(jié)果計算1.一只小鼠可獲得(1~2.5)×108個脾細胞。2.細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁,并開始生長,如接種的細胞密度適宜,5天到一周即可形成單層。3.一般情況,傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上,2~4天就可在瓶內(nèi)形成單層,需要再次進行傳代。四、注意事項1.取材要求新鮮,無菌,解剖小鼠時,注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器,尤其是腸道等,防止污染脾臟。2.沖洗脾臟時要盡量洗凈血污,去除無用組織,并要防止組織干燥。3.碾磨后及時用清水沖洗篩網(wǎng),防止組織、細胞阻塞網(wǎng)孔。4.計數(shù)前
體外細胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇22017/08/02
一、實驗原理細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細胞進行培養(yǎng)為原代培養(yǎng);當原代培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后,則需要做再培養(yǎng),即將培養(yǎng)的細胞分散后,從一個容器以1:2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng),為傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細胞的代數(shù)。細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以zui大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少
定量PCR實驗技術(shù)分享12017/08/02
1.如果擴增曲線ct值比較靠后的話,32左右,一般有什么方法解決沒有ct值比較靠后,對實驗有一定的影響,因為經(jīng)過那么多次的循環(huán),酶的活性有可能有所下降,這時候擴增效率會有所改變(而定量PCR的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴增效率我們認為是確定的一個值)。因此能夠把ct值往前移。解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。2.為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶,而內(nèi)參用同樣體系就沒有呢?引物被污染。3.實時定量PCR,熒光定量PCR,實時熒光定量PCR,real-timePCR
實時熒光定量PCR具體實驗步驟12017/08/02
1樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚仿相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10
單細胞凝膠電泳標準操作32017/03/02
實驗原理在細胞核中,DNA是環(huán)狀附著在核基質(zhì)上,細胞裂解過程中,核基質(zhì)被溶解、抽提,DNA的結(jié)構(gòu)則未發(fā)生變化。如果DNA鏈上存在缺口,則使DNA超螺旋變的松弛,DNA環(huán)向外展,同時由于暴露了陰電荷,在電場力的作用下,松動的DNA環(huán)向陽極遷移,但是由于這種松動的DNA環(huán)一端仍附著于核DNA,其遷移距離受到限制,因此尾長并不總是真實反映鏈缺口的多少。實際應(yīng)當依靠尾長與尾部的熒光強度同時來進行分析。實驗步驟1.分離制備單細胞懸液:1)體外培養(yǎng)的細胞株:用胰酶消化,吹打成單細胞懸液;2)體內(nèi)臟器細胞:處
多克隆抗體的免疫電泳操作流程2016/08/03
實驗原理免疫電泳又稱為γ球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術(shù),這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM,IgG,IgA含量水平的實驗方法。在這項實驗技術(shù)中,首先利用蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷的比值運用水平瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將蛋白質(zhì)進行分離,然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中,在抗原和抗體的擴散過程中,抗原和抗體適當比例的結(jié)合會導(dǎo)致沉淀的產(chǎn)生。0.85%鹽不僅可以終止擴散過程也可用于洗去未結(jié)合的蛋白,抗原和抗體結(jié)合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察。免疫電泳技術(shù)不僅可用于血清或
PCR擴增產(chǎn)物的鑒定2016/08/03
實驗原理生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中.它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H濃度或與其他大分子的相互作用。在電場中,帶電顆粒向陰極或陽極遷移.遷移的方向取決于它們帶電的符號.這種遷移現(xiàn)象即謂電泳。遷移的方式目前可以根據(jù)分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性分為三類。如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中,使顆粒具有一定遷移速率的驅(qū)動力來自于顆粒的有效電荷Q和電位梯度E。它們與介質(zhì)的摩擦阻力f抗衡:在自由溶液中,這種抗衡服從斯托克斯定律。f=6πrvη這里v是
單細胞凝膠電泳標準操作2016/08/03
實驗原理在細胞核中,DNA是環(huán)狀附著在核基質(zhì)上,細胞裂解過程中,核基質(zhì)被溶解、抽提,DNA的結(jié)構(gòu)則未發(fā)生變化。如果DNA鏈上存在缺口,則使DNA超螺旋變的松弛,DNA環(huán)向外展,同時由于暴露了陰電荷,在電場力的作用下,松動的DNA環(huán)向陽極遷移,但是由于這種松動的DNA環(huán)一端仍附著于核DNA,其遷移距離受到限制,因此尾長并不總是真實反映鏈缺口的多少。實際應(yīng)當依靠尾長與尾部的熒光強度同時來進行分析。實驗步驟1.分離制備單細胞懸液:1)體外培養(yǎng)的細胞株:用胰酶消化,吹打成單細胞懸液;2)體內(nèi)臟器細胞:處
RNAi實驗原理與方法2016/05/25
通過生化和遺傳學(xué)研究表明,RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititationandeffectorsteps)。在起始階段,加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。證據(jù)表明;一個稱為Dicer的酶,是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員,它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基,病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA,切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs),每個
酸性磷酸酶的顯示方法2016/05/25
實驗試劑1.10%中性福爾馬林(pH6.8~7.1)甲醛10ml蒸餾水90ml醋酸鈉2g2.酸性磷酸酶作用液蒸餾水90ml0.2mol/L醋酸緩沖液(pH4.6)12ml5%*2ml3.2%β—甘油磷酸鈉4ml先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合,隨后分成大致相等的兩份,一份中加*溶液,另一份加甘油磷酸鈉溶液,然后再將兩者緩緩混合,邊混邊攪勻后若酸堿度值不到pH5.0,可加少量醋酸的調(diào)整。此作用液在臨用前配制,不能貯存。配好后的作用液應(yīng)透明無絮狀懸浮物和沉淀,否則將嚴重影響實驗結(jié)果。4.1%硫化胺溶液硫化
IEF分離蛋白質(zhì)2015/12/04
實驗試劑樣品提取液(8M尿素、2%非離子型去污劑NP-40、2%Ampholin,pH3.5-10、2%DTT)膠母液(30%的29/1的Acr/Bis),兩性電解質(zhì)陽極緩沖液1M磷酸陰極緩沖液1M氫氧化鈉固定液(10%的三氯、1%的磺基水楊酸)染色液(35%乙醇、10%冰醋酸、0.15%考馬氏亮藍R250)脫色液(35%乙醇、10%冰醋酸)實驗設(shè)備高壓電泳儀、IEF槽、離心機等實驗步驟1.樣品提取1)1ml原核表達細胞液離心取沉淀2)沉淀用100ulIEF樣品緩沖液裂解,離心取上清2.制膠1)
土壤中有機氯農(nóng)藥的分析方法2015/12/04
實驗試劑丙酮、正己烷(J.T.Baker公司)均為農(nóng)殘級;甲醇(Fisherchemical公司)為色譜純;銅片為分析純(臨用時,先用6mol/L的鹽酸去除其氧化層,用去離子水洗至中性,然后依次用甲醇、丙酮、正己烷洗滌3次);無水硫酸鈉為分析純(400℃烘4h,冷卻后儲于密閉容器中);硅膠為分析純(先用甲醇洗滌,然后用二氯甲烷洗滌,在110℃烘干過;使用前在250℃烘24h,冷卻后儲于密閉容器中)。Florisil小柱(SUPELCO公司),1000mg(6mL);20種有機氯混合標準溶液(Ac
ABO血型的鑒定2015/12/04
實驗原理ABO血型是根據(jù)紅細胞表面存在的凝集原決定的。存在A凝集原的稱為A血型,存在B凝集原的稱為B血型。而血清中還存在凝集素。當A凝集原與抗A凝集素相遇或B凝集原與抗B凝集素相遇時,會發(fā)生紅細胞凝集反應(yīng)。一般A型標準血清中含有抗B凝集素,B型標準血清中含有抗A凝集素,因此可以用標準血清中的凝集素與被測者紅細胞反應(yīng),以確定其血型。同種動物不同個體的紅細胞凝集稱為同族血細胞凝集作用。不同動物的血液互相混合有時也可產(chǎn)生紅細胞凝集,稱為異族血細胞凝集作用。對于動物的天然血型抗體了解不多,而且免疫效價也
霉菌的形態(tài)觀察2015/12/04
實驗原理霉菌菌絲較粗大,細胞易收縮變形,而且孢子很容易飛散,所以制標本時常用乳酸石炭酸棉藍染色液。此染色液制成的霉菌標本片其特點是:(a)細胞不變形;(b)具有殺菌防腐作用,且不易干燥,能保持較長時間;(c)溶液本身呈藍色,有一定染色效果。霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài),常用載玻片觀察,此法是接種霉菌孢子于載玻片上的適宜培養(yǎng)基上,培養(yǎng)后用顯微鏡觀察。此外,為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進行觀察。此法是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性,將霉菌生長在覆蓋于瓊脂培養(yǎng)基表面的
玫瑰花環(huán)試驗2015/08/27
實驗原理動物T淋巴細胞表面具有結(jié)合異種動物紅細胞的受體,稱為E受體,在體外一定條件下,能與綿羊等動物的紅細胞結(jié)合,形成以T細胞為中心,紅細胞環(huán)繞在周圍,宛似一朵玫瑰花樣的花環(huán),故取名為E玫瑰花環(huán)試驗(erythrocyterosettesassay)或自然花環(huán)形成試驗。凡能與RBC形成E花環(huán)的淋巴細胞稱E花環(huán)形成細胞(Erosetteformingcell,ERFC)。目前*綿羊紅細胞(SRBC)受體是人、騾、牛、山羊、豬等T淋巴細胞的特異標志,ERFC就是T細胞。這種玫瑰花環(huán)形成不需任何物質(zhì)的
細胞凝集反應(yīng)2015/08/27
實驗原理細胞質(zhì)膜是由蛋白質(zhì)不同程度鑲嵌在脂雙層中所形成的動態(tài)流動結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)和脂類分子又與寡糖鏈結(jié)合為糖蛋白和糖脂分子,糖蛋白和糖脂分子伸至細胞表面的分枝狀寡糖鏈在質(zhì)膜表面形成細胞外被(又稱為糖萼)。許多研究結(jié)果表明:細胞間的分子識別、細胞的生長和分化、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等均與細胞外被(分枝狀寡糖鏈)有關(guān)。凝集素(lectin)是一類含糖的(少數(shù)凝集素例外)并能與糖進行專一性結(jié)合的蛋白質(zhì),它具有凝集細胞和刺激細胞分裂的作用。凝集素促使細胞凝集主要是由于它能與細胞外被的糖分子相連接、在細胞間形成“
細菌的革蘭氏染色和特殊形態(tài)觀察2015/08/27
實驗原理染色方法:革蘭染色法是細菌學(xué)中zui廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。方法是先將細菌用結(jié)晶紫染色,加媒染劑(增加染料和細胞的親和力)后,用脫色劑(酒精或丙酮)脫色,再用復(fù)染劑染色。如果細菌不被脫色而保存原染液顏色者為革蘭陽性菌(G+);如被脫色,而染上復(fù)染液的顏色者為革蘭陰性菌(G-)。此染色法可將所有具有細胞壁的細菌分為兩大類:革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。單染色法:只能觀察微生物的大小、形狀、和細胞排列狀況,但不能鑒別微生物以及它的特殊構(gòu)造等。復(fù)染色法:用兩種或兩
冷凍組織切片制作2015/08/27
實驗試劑液氮,干冰,1%明膠,4%多聚甲醛,PBS,含1%NP-40的PBS,3%BSA/PBS稀釋抗體,辣根過氧化物酶標記的二抗,DAB/金屬鹽試劑,3%過氧化氫,0.3%(W/V)氯化鎳貯存液,Harris蘇木精,乙醇實驗設(shè)備載玻片,Whatman1#濾紙,低倍光學(xué)顯微鏡實驗材料未受損傷的組織實驗步驟1.將未受損傷的組織切剖成小樣本,約lcmXIcmX0.4cm。2.將標本放在卡片的一端。標記該卡片,將帶有標本的一端浸入液氮中。60s后,取出標本并放在干冰上。修剪卡片,使其大小剛好比組織塊稍
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