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質(zhì)粒抽提過程中內(nèi)毒素如何去除？2022/05/28

內(nèi)毒素，即脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）細胞膜的組成部分。細菌外膜的外層脂質(zhì)部分是*由內(nèi)毒素分子所構(gòu)成的。單個大腸桿菌細胞約包含兩百萬個LPS分子，每個LPS分子由疏水的脂質(zhì)A（lipidA）部分、復(fù)雜的糖類殘基陣列部分及負電性的磷酸基團所組成。因此，每個內(nèi)毒素分子都具有疏水域、親水域和電荷域，這使它在與其他分子相互作用時具有其*的自身性質(zhì)。細菌在其活性生長期向其周圍微環(huán)境中散布少量的內(nèi)毒素，在死亡時則釋放大量內(nèi)毒素。在質(zhì)粒制備的細菌細胞裂解過程中，內(nèi)毒素分子被從外膜釋放到溶菌液中

原代培養(yǎng)經(jīng)驗分享2017/08/02

經(jīng)驗分享：1.原代細胞鋪満瓶底后棄原液，PBS沖洗2次。2.加入0.25%Trypsin-0.02%EDTA,量覆蓋瓶底即可，室溫作用，鏡下觀察至組織塊周圍的細胞回縮，立體感增強。3.棄去消化液，PBS輕漂一遍(目的是除去EDTA，它對脆弱的原代細胞很不好)但不要用力搖晃，以免部分消化稍過的細胞流失。4.加入培養(yǎng)液吹打，不要產(chǎn)生氣泡，對細胞有損。5.吸出2/3的懸液傳入新瓶。6.向原瓶中余下的1/3細胞懸液中補加2/3的新培養(yǎng)液，與未消化的組織塊繼續(xù)培養(yǎng)。7.24小時內(nèi)新的細胞又從組織塊中爬出啦

體外細胞的原代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇，傳代培養(yǎng)2017/08/02

三、實驗結(jié)果計算1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個脾細胞。2.細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。3.一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進行傳代。四、注意事項1.取材要求新鮮，無菌，解剖小鼠時，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器，尤其是腸道等，防止污染脾臟。2.沖洗脾臟時要盡量洗凈血污，去除無用組織，并要防止組織干燥。3.碾磨后及時用清水沖洗篩網(wǎng)，防止組織、細胞阻塞網(wǎng)孔。4.計數(shù)前

體外細胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇22017/08/02

一、實驗原理細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細胞進行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當原代培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細胞的代數(shù)。細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以zui大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少

定量PCR實驗技術(shù)分享12017/08/02

1.如果擴增曲線ct值比較靠后的話，32左右，一般有什么方法解決沒有ct值比較靠后，對實驗有一定的影響，因為經(jīng)過那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降，這時候擴增效率會有所改變（而定量PCR的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴增效率我們認為是確定的一個值）。因此能夠把ct值往前移。解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。2.為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶，而內(nèi)參用同樣體系就沒有呢?引物被污染。3.實時定量PCR，熒光定量PCR，實時熒光定量PCR，real－timePCR

實時熒光定量PCR具體實驗步驟12017/08/02

1樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10

單細胞凝膠電泳標準操作32017/03/02

實驗原理在細胞核中，DNA是環(huán)狀附著在核基質(zhì)上，細胞裂解過程中，核基質(zhì)被溶解、抽提，DNA的結(jié)構(gòu)則未發(fā)生變化。如果DNA鏈上存在缺口，則使DNA超螺旋變的松弛，DNA環(huán)向外展，同時由于暴露了陰電荷，在電場力的作用下，松動的DNA環(huán)向陽極遷移，但是由于這種松動的DNA環(huán)一端仍附著于核DNA，其遷移距離受到限制，因此尾長并不總是真實反映鏈缺口的多少。實際應(yīng)當依靠尾長與尾部的熒光強度同時來進行分析。實驗步驟1.分離制備單細胞懸液：1)體外培養(yǎng)的細胞株：用胰酶消化，吹打成單細胞懸液；2)體內(nèi)臟器細胞：處

多克隆抗體的免疫電泳操作流程2016/08/03

實驗原理免疫電泳又稱為γ球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術(shù)，這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM,IgG,IgA含量水平的實驗方法。在這項實驗技術(shù)中，首先利用蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷的比值運用水平瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將蛋白質(zhì)進行分離，然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗體的擴散過程中，抗原和抗體適當比例的結(jié)合會導(dǎo)致沉淀的產(chǎn)生。0.85%鹽不僅可以終止擴散過程也可用于洗去未結(jié)合的蛋白，抗原和抗體結(jié)合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察。免疫電泳技術(shù)不僅可用于血清或

PCR擴增產(chǎn)物的鑒定2016/08/03

實驗原理生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中．它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H濃度或與其他大分子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移．遷移的方向取決于它們帶電的符號．這種遷移現(xiàn)象即謂電泳。遷移的方式目前可以根據(jù)分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性分為三類。如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中，使顆粒具有一定遷移速率的驅(qū)動力來自于顆粒的有效電荷Q和電位梯度E。它們與介質(zhì)的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中，這種抗衡服從斯托克斯定律。f=6πrvη這里v是

單細胞凝膠電泳標準操作2016/08/03

實驗原理在細胞核中，DNA是環(huán)狀附著在核基質(zhì)上，細胞裂解過程中，核基質(zhì)被溶解、抽提，DNA的結(jié)構(gòu)則未發(fā)生變化。如果DNA鏈上存在缺口，則使DNA超螺旋變的松弛，DNA環(huán)向外展，同時由于暴露了陰電荷，在電場力的作用下，松動的DNA環(huán)向陽極遷移，但是由于這種松動的DNA環(huán)一端仍附著于核DNA，其遷移距離受到限制，因此尾長并不總是真實反映鏈缺口的多少。實際應(yīng)當依靠尾長與尾部的熒光強度同時來進行分析。實驗步驟1.分離制備單細胞懸液：1)體外培養(yǎng)的細胞株：用胰酶消化，吹打成單細胞懸液；2)體內(nèi)臟器細胞：處

RNAi實驗原理與方法2016/05/25

通過生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititationａndeffectorsteps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。證據(jù)表明；一個稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個

酸性磷酸酶的顯示方法2016/05/25

實驗試劑1.10％中性福爾馬林(pH6．8～7．1)甲醛10ml蒸餾水90ml醋酸鈉2g2.酸性磷酸酶作用液蒸餾水90ml0．2mol／L醋酸緩沖液(pH4．6)12ml5％*2ml3.2％β—甘油磷酸鈉4ml先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合，隨后分成大致相等的兩份，一份中加*溶液，另一份加甘油磷酸鈉溶液，然后再將兩者緩緩混合，邊混邊攪勻后若酸堿度值不到pH5．0，可加少量醋酸的調(diào)整。此作用液在臨用前配制，不能貯存。配好后的作用液應(yīng)透明無絮狀懸浮物和沉淀，否則將嚴重影響實驗結(jié)果。4.1％硫化胺溶液硫化

IEF分離蛋白質(zhì)2015/12/04

實驗試劑樣品提取液（8M尿素、2％非離子型去污劑NP－40、2％Ampholin，pH3.5-10、2％DTT）膠母液（30％的29/1的Acr/Bis），兩性電解質(zhì)陽極緩沖液1M磷酸陰極緩沖液1M氫氧化鈉固定液（10％的三氯、1％的磺基水楊酸）染色液（35％乙醇、10％冰醋酸、0.15%考馬氏亮藍R250）脫色液（35％乙醇、10％冰醋酸）實驗設(shè)備高壓電泳儀、IEF槽、離心機等實驗步驟1.樣品提取1)1ml原核表達細胞液離心取沉淀2)沉淀用100ulIEF樣品緩沖液裂解，離心取上清2.制膠1)

土壤中有機氯農(nóng)藥的分析方法2015/12/04

實驗試劑丙酮、正己烷（J.T.Baker公司）均為農(nóng)殘級；甲醇（Fisherchemical公司）為色譜純；銅片為分析純(臨用時，先用6mol/L的鹽酸去除其氧化層，用去離子水洗至中性，然后依次用甲醇、丙酮、正己烷洗滌3次)；無水硫酸鈉為分析純（400℃烘4h，冷卻后儲于密閉容器中）；硅膠為分析純（先用甲醇洗滌，然后用二氯甲烷洗滌，在110℃烘干過；使用前在250℃烘24h，冷卻后儲于密閉容器中）。Florisil小柱（SUPELCO公司），1000mg(6mL)；20種有機氯混合標準溶液（Ac

ABO血型的鑒定2015/12/04

實驗原理ABO血型是根據(jù)紅細胞表面存在的凝集原決定的。存在A凝集原的稱為A血型，存在B凝集原的稱為B血型。而血清中還存在凝集素。當A凝集原與抗A凝集素相遇或B凝集原與抗B凝集素相遇時，會發(fā)生紅細胞凝集反應(yīng)。一般A型標準血清中含有抗B凝集素，B型標準血清中含有抗A凝集素，因此可以用標準血清中的凝集素與被測者紅細胞反應(yīng)，以確定其血型。同種動物不同個體的紅細胞凝集稱為同族血細胞凝集作用。不同動物的血液互相混合有時也可產(chǎn)生紅細胞凝集，稱為異族血細胞凝集作用。對于動物的天然血型抗體了解不多，而且免疫效價也

霉菌的形態(tài)觀察2015/12/04

實驗原理霉菌菌絲較粗大，細胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標本時常用乳酸石炭酸棉藍染色液。此染色液制成的霉菌標本片其特點是：(a)細胞不變形；(b)具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長時間；(c)溶液本身呈藍色，有一定染色效果。霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)，常用載玻片觀察，此法是接種霉菌孢子于載玻片上的適宜培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用顯微鏡觀察。此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進行觀察。此法是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長在覆蓋于瓊脂培養(yǎng)基表面的

玫瑰花環(huán)試驗2015/08/27

實驗原理動物T淋巴細胞表面具有結(jié)合異種動物紅細胞的受體，稱為E受體，在體外一定條件下，能與綿羊等動物的紅細胞結(jié)合，形成以T細胞為中心，紅細胞環(huán)繞在周圍，宛似一朵玫瑰花樣的花環(huán)，故取名為E玫瑰花環(huán)試驗(erythrocyterosettesassay)或自然花環(huán)形成試驗。凡能與RBC形成E花環(huán)的淋巴細胞稱E花環(huán)形成細胞(Erosetteformingcell，ERFC)。目前*綿羊紅細胞(SRBC)受體是人、騾、牛、山羊、豬等T淋巴細胞的特異標志，ERFC就是T細胞。這種玫瑰花環(huán)形成不需任何物質(zhì)的

細胞凝集反應(yīng)2015/08/27

實驗原理細胞質(zhì)膜是由蛋白質(zhì)不同程度鑲嵌在脂雙層中所形成的動態(tài)流動結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)和脂類分子又與寡糖鏈結(jié)合為糖蛋白和糖脂分子，糖蛋白和糖脂分子伸至細胞表面的分枝狀寡糖鏈在質(zhì)膜表面形成細胞外被（又稱為糖萼）。許多研究結(jié)果表明：細胞間的分子識別、細胞的生長和分化、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等均與細胞外被（分枝狀寡糖鏈）有關(guān)。凝集素（lectin）是一類含糖的（少數(shù)凝集素例外）并能與糖進行專一性結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細胞和刺激細胞分裂的作用。凝集素促使細胞凝集主要是由于它能與細胞外被的糖分子相連接、在細胞間形成“

細菌的革蘭氏染色和特殊形態(tài)觀察2015/08/27

實驗原理染色方法：革蘭染色法是細菌學(xué)中zui廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。方法是先將細菌用結(jié)晶紫染色，加媒染劑（增加染料和細胞的親和力）后，用脫色劑（酒精或丙酮）脫色，再用復(fù)染劑染色。如果細菌不被脫色而保存原染液顏色者為革蘭陽性菌(G＋)；如被脫色，而染上復(fù)染液的顏色者為革蘭陰性菌(G-)。此染色法可將所有具有細胞壁的細菌分為兩大類：革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。單染色法：只能觀察微生物的大小、形狀、和細胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構(gòu)造等。復(fù)染色法：用兩種或兩

冷凍組織切片制作2015/08/27

實驗試劑液氮，干冰，1％明膠，4％多聚甲醛，PBS，含1％NP-40的PBS，3％BSA／PBS稀釋抗體，辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB／金屬鹽試劑，3％過氧化氫，0.3％(W／V)氯化鎳貯存液，Harris蘇木精，乙醇實驗設(shè)備載玻片，Whatman1＃濾紙，低倍光學(xué)顯微鏡實驗材料未受損傷的組織實驗步驟1.將未受損傷的組織切剖成小樣本，約lcmXIcmX0.4cm。2.將標本放在卡片的一端。標記該卡片，將帶有標本的一端浸入液氮中。60s后，取出標本并放在干冰上。修剪卡片，使其大小剛好比組織塊稍