免疫組化技術(shù)服務(wù)

工作原理：辣根過氧化物酶（HRP）的分子量（40000），它不會(huì)遮蓋抗原的結(jié)合部位，具有較高活性及特異性，可溶性佳，生成的產(chǎn)物不擴(kuò)散，可作用于多種底物，產(chǎn)生不同顏色且HRP穿透力強(qiáng)，易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。DAB在 H2O2存在的情況下，可以作為HRP的電子供體，產(chǎn)生褐色的不溶顆粒，可作為顯色的試劑。
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試劑內(nèi)容：
 名稱    規(guī)格
1、0.01mol/L pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液  1L
2 、PBS緩沖液  2L
3、 廣譜二抗  3mL
4 、30%H2O2  10 mL
5 、DAB顯色液I  0.6mL
6 、DAB顯色液II  0.6mL

自備試劑：無水乙醇、蘇木素。
 

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操作步驟：
1、60℃常規(guī)脫蠟至水后，將石蠟切片先后浸入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各10min。然后逐級降濃度酒精入水，每次3-5 min。
① * 3－5min
② 90% 酒精 3－5min
③ 85% 酒精 3－5min
④ 75% 酒精 3－5min
⑤ PBS洗滌3次 每次5 min
2、熱修復(fù)抗原： 將切片置于0.01mol/L pH6.0枸櫞鈉緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10 min后，反復(fù)1-2 次，置于室溫自然冷卻。0.01 mol/L  pH7.0左右的PBS洗滌3次，每次5 min
3、消除內(nèi)源性過氧化物酶：用3% H 2 O 2 室溫孵育 5-10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗滌2-3次，每次5 min；
4、滴加一抗： 滴加適當(dāng)稀釋的一抗到切片上，37℃孵育1小時(shí)左右或者4℃過一夜， pH7.4的PBS洗滌3次，每次5 min 。（一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說，陽性染色強(qiáng)度不夠時(shí)，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時(shí)間；背景過高時(shí)，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間。）
5、加入廣譜二抗，37℃孵育1小時(shí)，取出后PBS洗滌3次，每次5 min。
6、DAB顯色： 取DAB顯色液I及II各50微升加至入1mL的水中，配成DAB工作液，滴加到切片上，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。蒸餾水充分洗滌以終止反應(yīng)。
7、觀察顯色后自來水沖，蘇木精復(fù)染1-2min，，自來水沖10min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，干燥，分析拍照