1. 新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片（ 也可- 80℃保存），厚度為 5～6μm。

2. 載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風(fēng)吹干。

3. 如不馬上染色，可密封后- 20℃保存。

4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分鐘。

5. PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘，（ 必要時(shí)應(yīng)用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔）

6. 3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，20 分鐘，避光;

7. 用 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘;

8. 正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài),）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動(dòng)物血清）處理，37℃，15 分鐘。

附：正常血清配制 （ 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制）：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl （10%拋灑量） 計(jì)算。

9.滴加*抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加*抗體，37℃ 2 小時(shí)（也可置于 4℃冰箱過(guò)整夜） 。

10.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

11.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分鐘。

12.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

13.滴加三抗 （SAB 復(fù)合物） ，37℃，40 分鐘。

14.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

15.DAB 顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止（自來(lái)水沖終止） 。

附：DAB 的配制① 儲(chǔ)備液（DAB 25mg/ml）的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待*溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，凍存。② 工作液：DAB 儲(chǔ)備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

16.自來(lái)水（細(xì)水）充分沖洗。

17.蘇木素復(fù)染，室溫，30 秒，自來(lái)水沖洗。

18.自來(lái)水沖洗返藍(lán)，15 分鐘。

19.梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 95%，2 分鐘 100%，2 次，5 分鐘。

20.二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘

21.封片：加拿大樹(shù)膠（或中性樹(shù)膠）封片。