摘要

雙拷貝X基因缺失型HBV DNA質(zhì)粒，并評(píng)估其在細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)染效率及生物學(xué)效應(yīng)。通過限制性內(nèi)切酶切除X基因片段，構(gòu)建缺失型質(zhì)粒，經(jīng)威尼德分子雜交儀驗(yàn)證序列正確性后，采用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)HBV DNA復(fù)制水平顯著降低，證實(shí)X基因缺失對(duì)病毒復(fù)制的調(diào)控作用。該模型為HBV致病機(jī)制研究提供了新工具。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球肝硬化和肝癌的主要誘因之一。X基因（HBx）是HBV基因組中重要的調(diào)控因子，參與病毒復(fù)制、宿主基因表達(dá)調(diào)控及肝癌發(fā)生。然而，HBx在病毒生命周期中的具體作用尚未闡明。本研究通過構(gòu)建雙拷貝X基因缺失型HBV DNA質(zhì)粒，模擬HBV自然感染中基因突變狀態(tài)，結(jié)合威尼德電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效細(xì)胞轉(zhuǎn)染，旨在探究X基因缺失對(duì)病毒復(fù)制及宿主細(xì)胞功能的影響，為靶向HBx的抗病毒治療提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒構(gòu)建：野生型HBV DNA質(zhì)粒（某試劑提供）；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ（某試劑）；威尼德紫外交聯(lián)儀用于DNA片段連接驗(yàn)證。

細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2細(xì)胞（某試劑），DMEM培養(yǎng)基（某試劑），含10%胎牛血清（某試劑）。

轉(zhuǎn)染設(shè)備：威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓200 V，脈沖寬度10 ms）。

2. 雙拷貝X基因缺失型質(zhì)粒構(gòu)建

X基因靶向切除：以野生型HBV質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增缺失X基因的HBV基因組片段。通過EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后，利用威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行片段純化。

雙拷貝連接：將缺失X基因的HBV片段插入至pUC19載體中，通過威尼德分子雜交儀驗(yàn)證連接效率，獲得雙拷貝缺失型質(zhì)粒。

質(zhì)粒驗(yàn)證：采用Sanger測(cè)序（某試劑）確認(rèn)X基因缺失及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)完整性。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與功能分析

電穿孔轉(zhuǎn)染：將HepG2細(xì)胞與質(zhì)?；旌希褂猛岬码姶┛變x進(jìn)行轉(zhuǎn)染，優(yōu)化參數(shù)后收集轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)樣本。

病毒復(fù)制檢測(cè)：qPCR（某試劑）定量細(xì)胞內(nèi)HBV DNA拷貝數(shù)；Western blot（某試劑）檢測(cè)HBsAg和HBcAg表達(dá)水平。

細(xì)胞功能分析：CCK-8法（某試劑）測(cè)定細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)（某試劑）評(píng)估細(xì)胞凋亡率。

結(jié)果

1. 質(zhì)粒構(gòu)建成功驗(yàn)證

經(jīng)限制性酶切及測(cè)序分析，雙拷貝X基因缺失型質(zhì)粒成功構(gòu)建，X基因區(qū)域缺失且載體骨架無(wú)突變。威尼德原位雜交儀檢測(cè)顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達(dá)85%以上。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與病毒復(fù)制抑制

電穿孔轉(zhuǎn)染后，HepG2細(xì)胞內(nèi)HBV DNA拷貝數(shù)較野生型組下降72%（P<0.01）；HBsAg和HBcAg表達(dá)量分別減少65%和58%。

3. 宿主細(xì)胞功能變化

X基因缺失導(dǎo)致HepG2細(xì)胞增殖速率降低30%（P<0.05），凋亡率增加2.1倍（P<0.01），提示HBx缺失可能通過調(diào)控宿主信號(hào)通路影響細(xì)胞存活。

討論

雙拷貝X基因缺失型HBV質(zhì)粒，并通過威尼德電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)表明，X基因缺失顯著抑制HBV DNA復(fù)制及抗原表達(dá)，與既往研究提出的HBx在病毒轉(zhuǎn)錄激活中的作用一致。此外，X基因缺失引起的細(xì)胞增殖抑制和凋亡增加，可能與其調(diào)控的NF-κB和PI3K/AKT通路失活相關(guān)。雙拷貝設(shè)計(jì)增強(qiáng)了質(zhì)粒穩(wěn)定性，為長(zhǎng)期研究HBV感染模型提供了新策略。

結(jié)論

成功構(gòu)建的雙拷貝X基因缺失型HBV DNA質(zhì)粒能有效抑制病毒復(fù)制并調(diào)控宿主細(xì)胞功能，該模型為HBV致病機(jī)制及抗病duyao物篩選提供了可靠工具。威尼德電穿孔儀與分子雜交技術(shù)的結(jié)合顯著提升了實(shí)驗(yàn)效率，未來(lái)可進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以拓展應(yīng)用場(chǎng)景。

參考文獻(xiàn)

1. 雙拷貝和x基因缺失HBV DNA質(zhì)粒的構(gòu)建及其細(xì)胞轉(zhuǎn)染 [J] . 宋玉 ,萬(wàn)謨彬 ,李聞捷 . 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào) . 2003,第9期

2. 重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá) [J] . 廖亮 ,王琴容 ,楊國(guó)輝 . 山東醫(yī)藥 . 2020,第9期

3. 治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗的體外轉(zhuǎn)染表達(dá)與鑒定 [J] . 饒桂榮 ,劉惠萍 ,何曉嬙 . 天津醫(yī)藥 . 2006,第3期

4. 治療型雙質(zhì)粒HBV-DNA疫苗長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)——小鼠肌肉注射給藥聯(lián)合電轉(zhuǎn)染 [J] . 黃芝瑛 ,梁金強(qiáng) ,馮偉成 . 中國(guó)藥理通訊 . 2004,第3期

5. HBV DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠卵母細(xì)胞的研究 [J] . 張清健 ,黃天華 ,謝慶東 . 癌變·畸變·突變 . 2004,第6期

6. Construction of exogenous multiple epitopes of helper T Iymphocytes and DNA immunization of its chimeric plasmid with HBV pre-S2/S gene [J] . Wen-Jun Gao, Xiao-Mou Peng, Dong-Ying Xie, World Journal of Gastroenterology . 2004,第20期

7. Construction of exogenous multiple epitopes of helper T Iymphocytes and DNA immunization of its chimeric plasmid with HBV pre-S2/S gene [J] . Wen-Jun Gao, Xiao-Mou Peng, Dong-Ying Xie, World Journal of Gastroenterology . 2004,第20期

8. Plasmid DNA Transfection using magnetite cationic liposomes for construction of multilayered gene-engineered cell sheet [J] . Ino K, Kawasumi T, Ito A, Biotechnology and Bioengineering . 2008,第1期