摘要

分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pSecTagEGFP，并利用威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)其在雞胚成纖維細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了載體完整性及EGFP蛋白表達(dá)效率，Western blot檢測(cè)顯示目的蛋白特異性表達(dá)。該研究為基因功能分析與蛋白表達(dá)調(diào)控提供了可靠工具。

引言

真核表達(dá)載體是基因功能研究與重組蛋白生產(chǎn)的核心工具，其設(shè)計(jì)需兼顧表達(dá)效率與穩(wěn)定性。pSecTag載體系統(tǒng)因攜帶分泌信號(hào)肽及多克隆位點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于分泌型蛋白研究。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）作為可視化標(biāo)記，可實(shí)時(shí)追蹤基因表達(dá)動(dòng)態(tài)。雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）作為經(jīng)典細(xì)胞模型，具有增殖快、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)勢(shì)，但其轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化仍具挑戰(zhàn)。

pSecTag為基礎(chǔ)骨架，插入EGFP基因，構(gòu)建pSecTagEGFP重組載體，并系統(tǒng)優(yōu)化CEF細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染參數(shù)，結(jié)合威尼德電穿孔儀的高效脈沖技術(shù)，旨在建立一種穩(wěn)定、高效的基因遞送體系，為后續(xù)基因編輯與蛋白分泌機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

質(zhì)粒提取與酶切：提取pSecTag2B母本質(zhì)粒，采用XhoⅠ和EcoRⅠ（某試劑）雙酶切，37℃反應(yīng)3小時(shí)，威尼德紫外交聯(lián)儀（0.12 J/cm2）回收線性化載體。

EGFP片段擴(kuò)增：以pEGFP-N1為模板，設(shè)計(jì)含XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物，通過高保真PCR擴(kuò)增EGFP片段（反應(yīng)體系：某試劑）。

連接與轉(zhuǎn)化：將酶切純化的載體與EGFP片段按3:1摩爾比混合，使用T4 DNA連接酶（某試劑）16℃連接12小時(shí)，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板。

1.2 陽性克隆篩選

菌落PCR鑒定：隨機(jī)挑取單菌落，以載體特異性引物擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證插入片段大小。

測(cè)序驗(yàn)證：選取PCR陽性克隆送測(cè)序，比對(duì)EGFP序列一致性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

CEF細(xì)胞制備：取9日齡SPF雞胚，機(jī)械分離心臟組織，0.25%胰酶（某試劑）消化后，以DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）傳代培養(yǎng)。

電轉(zhuǎn)染優(yōu)化：取第3代CEF細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10? cells/mL，與10 μg pSecTagEGFP質(zhì)?；旌?，采用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓200 V，脈寬10 ms，單脈沖），轉(zhuǎn)染后立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。

1.4 表達(dá)檢測(cè)

熒光顯微鏡觀察：轉(zhuǎn)染后24/48小時(shí)，威尼德倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP綠色熒光信號(hào)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。

Western blot分析：裂解細(xì)胞提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，抗EGFP一抗（某試劑）及HRP標(biāo)記二抗（某試劑）孵育，ECL顯色檢測(cè)。

2. 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建驗(yàn)證

酶切及測(cè)序結(jié)果顯示，pSecTagEGFP載體大小為6.8 kb，EGFP基因正確插入多克隆位點(diǎn)。菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期650 bp條帶一致，測(cè)序比對(duì)無誤。

2.2 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化

威尼德電穿孔儀參數(shù)優(yōu)化表明，200 V電壓下CEF細(xì)胞存活率達(dá)85%，EGFP表達(dá)陽性率約42%，顯著高于脂質(zhì)體法（15%）。熒光信號(hào)于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)顯著增強(qiáng)，48小時(shí)達(dá)峰值。

2.3 蛋白表達(dá)驗(yàn)證

Western blot在27 kDa處可見特異性條帶，與EGFP理論分子量一致，證實(shí)載體在CEF細(xì)胞中成功表達(dá)功能性蛋白。

討論

優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，顯著提升CEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。威尼德電穿孔儀的高效脈沖參數(shù)在保證細(xì)胞存活的同時(shí)，促進(jìn)質(zhì)?？缒みf送，較傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢(shì)。pSecTagEGFP載體可實(shí)現(xiàn)分泌型蛋白與EGFP的融合表達(dá)，適用于活細(xì)胞動(dòng)態(tài)追蹤及蛋白分泌途徑研究。

結(jié)論

成功構(gòu)建pSecTagEGFP真核表達(dá)載體，并建立基于威尼德電穿孔儀的CEF細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染體系。該體系為基因功能研究與重組蛋白生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐，具有廣泛的應(yīng)用潛力。

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