JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis

KWS：JAG1-NOTCH4；mechanosensing；atherosclerosis

血流產(chǎn)生機(jī)械剪切應(yīng)力，通過(guò)改變血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的生理機(jī)能，對(duì)血管功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。具有均勻幾何形狀的動(dòng)脈樹(shù)區(qū)域受到單向的高生理剪切應(yīng)力，發(fā)揮EC 保護(hù)作用并防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。然而，動(dòng)脈的分支和彎曲部分暴露于復(fù)雜的血流模式中，產(chǎn)生方向變化的低平均剪切應(yīng)力（如雙向振蕩和渦流），這些紊亂的血流條件會(huì)促進(jìn) EC 功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

Notch 信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程、調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)方面起至關(guān)重要的作用。哺乳動(dòng)物中有四個(gè)受體（Notch1-4）和五個(gè)配體（Delta-like（DLL）1，3，4和Jagged（Jag）1-2）。經(jīng)典研究表明，相鄰 EC 上 NOTCH1及其配體DLL4 之間的相互作用在血管生成過(guò)程中建立了“前端”與“柄”細(xì)胞身份，并且 NOTCH1 和 DLL4 通過(guò)抑制缺血組織中的 EC 增殖和新生血管形成對(duì)動(dòng)脈功能至關(guān)重要。Notch 的激活需要配體內(nèi)吞作用誘導(dǎo)的機(jī)械力，而NOTCH1 對(duì)剪切應(yīng)力的感應(yīng)在動(dòng)脈分化和血管穩(wěn)態(tài)保護(hù)中起重要作用。然而，Notch 系統(tǒng)在致動(dòng)脈粥樣硬化擾動(dòng)流的 EC 傳感中的潛在作用尚未得到研究。

基于此，英國(guó)謝菲爾德大學(xué)感染、免疫和心腦血管疾病系、中國(guó)西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院及美國(guó)芝加哥大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系等研究團(tuán)隊(duì)曾利用幾種互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)方法（豬動(dòng)脈、實(shí)驗(yàn)血流修飾的小鼠動(dòng)脈和培養(yǎng)的人EC）表明了擾動(dòng)流主要激活 JAG1-NOTCH4 通路。其條件性基因缺失表明，Jag1 特別是在易患病的血流紊亂區(qū)域增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化；單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和其他機(jī)制方法表明，JAG1-NOTCH4 信號(hào)通過(guò)抑制對(duì)增殖至關(guān)重要的 EC 亞群來(lái)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。這些數(shù)據(jù)從根本上推進(jìn)了我們對(duì) Notch 信號(hào)在解釋剪切應(yīng)力信號(hào)控制 EC 功能中的作用的認(rèn)識(shí)，并對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中 Notch 通路的治療靶向具有重要意義。研究成果發(fā)表在 Science Advances 期刊題為“JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis”。

實(shí)驗(yàn)假設(shè) Notch 受體和配體在暴露于不同流動(dòng)條件的動(dòng)脈位置可能具有不同的空間表達(dá)模式，通過(guò)qRT-PCR分析對(duì)從暴露于受干擾的低振蕩剪切應(yīng)力（LOSS）或高剪切應(yīng)力（HSS）的區(qū)域分離的豬主動(dòng)脈 EC 中 Notch 受體及其配體的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與 HSS 相比，JAG1 和 NOTCH4 mRNA 在 LOSS 位點(diǎn)的表達(dá)顯著增強(qiáng)，而 JAG2、DLL1、DLL3、DLL4、NOTCH1、NOTCH2 和 NOTCH3 的表達(dá)在這些位點(diǎn)之間相似（圖1 A）。

然后，量化小鼠主動(dòng)脈弓中 JAG1 和 NOTCH4 蛋白的表達(dá)。表面染色顯示，與小鼠主動(dòng)脈弓中的 HSS 區(qū)域相比，JAG1 和 NOTCH4 蛋白在 LOSS 區(qū)域的表達(dá)水平更高（圖1 B、C）。利用免疫熒光光片成像技術(shù)對(duì)高膽固醇血癥載脂蛋白E（ApoE）-/- 小鼠的病變動(dòng)脈區(qū)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與相鄰的非斑塊區(qū)域相比，JAG1 和 NOTCH4 在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊區(qū)域富集，表明其在動(dòng)脈粥樣硬化中具有潛在作用（圖1 D）。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1 和 NOTCH4 在動(dòng)脈粥樣硬化易感部位的內(nèi)皮細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中富集。

使用收縮袖帶改變小鼠頸動(dòng)脈的血流在下游產(chǎn)生振蕩剪切應(yīng)力，評(píng)估JAG1 和 NOTCH4 是否直接對(duì)剪切應(yīng)力敏感，結(jié)果顯示，14 天后下游區(qū)域的 JAG1 和 NOTCH4 顯著增強(qiáng)（圖1 E、F）。相比之下，JAG1 和 NOTCH4 的表達(dá)在具有生理血流的對(duì)側(cè)動(dòng)脈中幾乎檢測(cè)不到。因此，JAG1 和 NOTCH4 在袖帶內(nèi)曲率和下游區(qū)域的富集可能是對(duì) LOSS 的反應(yīng)。

圖1    JAG1和NOTCH4在動(dòng)脈粥樣硬化傾向位點(diǎn)富集。

進(jìn)一步地，分析人冠狀動(dòng)脈EC（HCAEC）對(duì)血流（LOSS：±4 dyne/cm2，0.5 Hz；HSS，13 dyne/cm2）的反應(yīng)。Notch 配體 JAG1、JAG2、DLL3 和 DLL4 的 mRNA 水平因 HCAEC 中的剪切應(yīng)力而顯著改變，其中 JAG1 在 LOSS 下表達(dá)最高（圖2 A）。此外，JAG1 是在蛋白質(zhì)水平上持續(xù)被 LOSS 增強(qiáng)的 Notch 配體（圖2 B），但DLL4 蛋白未受流動(dòng)影響（圖2 B）。在 Notch 受體中，NOTCH4 在 mRNA（圖2 A）和蛋白質(zhì)（圖2 C）水平上都因 LOSS 而增強(qiáng)，這與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加有關(guān)，NOTCH4活性和裂解的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（N4ICD）增加證明了這一點(diǎn)（圖2 C、D）。暴露于靜態(tài)條件下的 HCAEC 中的 JAG1 和 NOTCH4 mRNA 水平較低，證實(shí)它們具有流動(dòng)響應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1 和 NOTCH4 是暴露于 LOSS 的人 EC 中的主要 Notch 成分，這與體內(nèi)研究一致。

此外，使用 JAG1 的活性阻斷抗體和 DLL4 阻斷抗體作為對(duì)照進(jìn)行比較，研究了 JAG1 是否在 LOSS 下作用于 NOTCH4 的上游。在暴露于 LOSS 的 HCAEC 中，阻斷 JAG1 顯著降低了 N4ICD 激活，而阻斷 DLL4 活性沒(méi)有顯著影響（圖2 E）。anti-JAG1 或 anti-DLL4 阻斷抗體未改變 NOTCH4 mRNA 的總水平。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1 激活NOTCH4 是 LOSS 條件下的關(guān)鍵通路。

圖2   JAG1-NOTCH4通路是由LOSS體外誘導(dǎo)的。

接下來(lái)，為了描述內(nèi)皮 Jag1 在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，生成 EC 特異性Jag1 敲除小鼠，并暴露于高脂飲食產(chǎn)生高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化病變（圖3 A、B）。在高膽固醇血癥小鼠中，與對(duì)照組相比，Jag1^ECKO 小鼠整個(gè)主動(dòng)脈的病變面積顯著減少（圖3 C、D）。進(jìn)一步分析顯示，Jag1^ECKO  導(dǎo)致主動(dòng)脈弓病變面積減少，但降主動(dòng)脈（圖3 D）病變面積未減少，主動(dòng)脈根部的病變區(qū)域也沒(méi)有改變（圖3 E、F）。因此，Jag1 在具有特定流動(dòng)條件的解剖學(xué)不同部位上促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，尤其是在血流紊亂部位。

圖3   內(nèi)皮細(xì)胞Jag1的缺失減少了主動(dòng)脈弓斑塊的形成。

最后，為了闡明 JAG1 依賴性動(dòng)脈粥樣硬化的潛在機(jī)制，對(duì)對(duì)照和Jag1ECKO 主動(dòng)脈進(jìn)行scRNA-seq。SORT-seq 分析確定了 14 個(gè)不同的集群。其中，簇 0-11 一致表達(dá)多種 EC 標(biāo)志物，與以前發(fā)表的小鼠主動(dòng)脈的 EC 簇非常相似。這些觀察結(jié)果證實(shí)了正常小鼠主動(dòng)脈中存在異質(zhì)性。簇 4-6 中的大多數(shù)細(xì)胞來(lái)自 Jag1ECKO 小鼠，而簇 2 和 7-11 的細(xì)胞主要來(lái)自對(duì)照小鼠，表明 Jag1 對(duì) EC 異質(zhì)性有深遠(yuǎn)的影響。特別是，與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的多個(gè) GO terms 在 Jag1ECKO 小鼠富集，表明 Jag1 抑制參與增殖和遷移的 EC 亞型。

然后，分析了體外暴露于 LOSS 的 HCAEC 中的 JAG1 功能。RNA-seq 顯示 859 個(gè)基因因抑制 JAG1 而顯著改變，DAVID功能注釋發(fā)現(xiàn)，最高度富集的 GO terms 集中在細(xì)胞分裂過(guò)程和細(xì)胞分裂/遷移（圖4 A-C）。因此，確定 JAG1 是 EC 增殖的調(diào)節(jié)因子。通過(guò)使用基因沉默或活性阻斷抗體抑制 JAG1-NOTCH4 通路可顯著增強(qiáng) LOSS 下的 HCAEC 增殖和遷移，證實(shí)了這一聯(lián)系（圖4 D、E）。此外，pan-Notch 抑制劑DAPT 增強(qiáng)了暴露于 LOSS 的 HCAEC 的增殖，這與 JAG1 水平降低相關(guān)，而 DLL4 沒(méi)有改變，從而進(jìn)一步證實(shí)了擾動(dòng)流下 JAG1、Notch 與增殖之間的聯(lián)系。同樣，Jag1 的缺失導(dǎo)致暴露于 LOSS 的小鼠主動(dòng)脈區(qū)域的 EC 增殖增加（圖4 F），但不影響暴露于 HSS 的區(qū)域的 EC 增殖。因此，JAG1-NOTCH4 通路在擾動(dòng)流下抑制了增殖和遷移。

為了研究 JAG1 的作用是否具有細(xì)胞自主性，分析了 JAG1 沉默細(xì)胞是否可以影響共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理細(xì)胞的增殖均顯著增強(qiáng)，表明 JAG1 通過(guò)非細(xì)胞自主機(jī)制驅(qū)動(dòng)增殖，其機(jī)制可能涉及細(xì)胞間接觸。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1-NOTCH4 的LOSS 感應(yīng)通過(guò)改變 EC 異質(zhì)性以抑制控制增殖和遷移的 EC 亞群來(lái)增強(qiáng)疾病易感性。

圖4    LOSS激活JAG1導(dǎo)致內(nèi)皮修復(fù)受到抑制。

圖5    動(dòng)脈粥樣硬化中JAG1-NOTCH4 控制修復(fù)性內(nèi)皮亞群的假設(shè)。

實(shí)驗(yàn)假設(shè) LOSS 激活 JAG1-NOTCH4 信號(hào)，通過(guò)改變修復(fù)性和致病性 EC 亞群的平衡來(lái)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。

總之，JAG1-NOTCH4 對(duì) LOSS 的感應(yīng)通過(guò)改變 EC 異質(zhì)性促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，實(shí)驗(yàn)假設(shè)該通路抑制了負(fù)責(zé)血管修復(fù)的亞群。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1-NOTCH4 在感知疾病引發(fā)的 LOSS 中具有重要作用，并表明 JAG1-NOTCH4 的治療靶向可能是一種新的治療策略，可增強(qiáng)修復(fù)性 EC 亞群以預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化。

參考文獻(xiàn)：Souilhol C, Tardajos Ayllon B, Li X, Diagbouga MR, Zhou Z, Canham L, Roddie H, Pirri D, Chambers EV, Dunning MJ, Ariaans M, Li J, Fang Y, J?rgensen HF, Simons M, Krams R, Waltenberger J, Fragiadaki M, Ridger V, De Val S, Francis SE, Chico TJ, Serbanovic-Canic J, Evans PC. JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis. Sci Adv. 2022 Sep 2;8(35):eabo7958. doi: 10.1126/sciadv.abo7958. Epub 2022 Aug 31. PMID: 36044575; PMCID: PMC9432841.

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