支原體（Mycoplasma）又稱霉形體，是目前發(fā)現(xiàn)的最小、簡單的無細(xì)胞壁的原核生物，直徑大小0.1~0.3μm，能通過濾膜且呈高度多形性，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中相對(duì)常見且難以檢測的污染物。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。

支原體（mycoplasma）是細(xì)菌中最小的一種微生物，在生物學(xué)分類中屬于柔膜菌門、柔膜菌綱，又分屬于不同目科屬。其中研究較多的支原體目、支原體科，主要包含支原體屬、脲原體屬兩個(gè)種屬。

支原體污染對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成多方面的不良影響，已經(jīng)成為在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的一個(gè)嚴(yán)重問題，保守估計(jì)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染率為15~35%，嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

細(xì)胞培養(yǎng)中95%的支原體污染主要是由萊氏無膽甾原體、精氨酸支原體、口腔支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、豬鼻支原體引起的。支原體在培養(yǎng)基上，形成的菌落呈“煎雞蛋“形狀。細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞膜適宜支原體生長，寄生在細(xì)胞表面的支原體可以穿透宿主細(xì)胞膜。

支原體污染來源主要有：細(xì)胞培養(yǎng)液或其成分（如培養(yǎng)基原料、血清和其他試劑）、實(shí)驗(yàn)室操作人員、細(xì)胞培養(yǎng)箱、液氮培養(yǎng)箱、空氣中的粒子和氣溶膠、抗生素的過度使用、密封不當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物和污染了支原體的細(xì)胞等。

與此同時(shí)，這些污染對(duì)應(yīng)的危害為：導(dǎo)致細(xì)胞制品或以細(xì)胞為介質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)的產(chǎn)品在下游純化過程中可能因未能有效去除支原體而造成批次報(bào)廢、污染其接觸的所有相關(guān)設(shè)備設(shè)施甚至中間或終產(chǎn)品、導(dǎo)致其他正常細(xì)胞受到支原體污染、導(dǎo)致重要細(xì)胞或病毒種子庫受到支原體污染而報(bào)廢、導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室整體環(huán)境受到污染而被迫停止生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)操作進(jìn)行支原體去除、導(dǎo)致支原體產(chǎn)生耐受性而更難以去除、支原體污染面積擴(kuò)大、對(duì)實(shí)驗(yàn)室中的其他細(xì)胞培養(yǎng)物造成威脅。

圖3. 支原體污染的危害

因此，定期進(jìn)行支原體檢測和去除，確保無支原體存在細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)才能保障科學(xué)研究工作的正常進(jìn)行。

在生物制藥和細(xì)胞研究中，支原體污染是一個(gè)嚴(yán)重的問題，因?yàn)樗赡苡绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果和產(chǎn)品質(zhì)量。因此，支原體檢測對(duì)于確保細(xì)胞培養(yǎng)物和生物制品的安全性和可靠性至關(guān)重要。

目前常用的支原體檢測方法包括培養(yǎng)法、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法、熒光染色法、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）法、qPCR（實(shí)時(shí)定量PCR）、代謝活性測定（eg. ATP酶法）等。各種支原體檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)如下：

表1.不同支原體檢測方法對(duì)比

合適支原體檢測方法的建立，需要考慮檢測結(jié)果僅用于參考還是用于產(chǎn)品相關(guān)樣本等的放行，是否符合法規(guī)藥典要求、是否做了方法驗(yàn)證確認(rèn)了方法的靈敏度、專屬性和耐用性，是否與藥典方法可比等。

若涉及產(chǎn)品放行的支原體檢測，需使用藥典規(guī)定方法，即培養(yǎng)法或指示細(xì)胞法，或者經(jīng)驗(yàn)證與藥典規(guī)定可比的NAT法（如qPCR法，一般驗(yàn)證越早開展越好）。

若不涉及產(chǎn)品放行的支原體檢測，即對(duì)于日常檢測用細(xì)胞或者研發(fā)早期的細(xì)胞等，快速檢測支原體的方法作為，其中包括巢式PCR法、LAMP等溫?cái)U(kuò)增法、qPCR法、ATP酶法和ELISA法。

基于NAT (nucleic acid amplification techniques)核酸擴(kuò)增技術(shù)，翌圣生物開發(fā)了一系列支原體快速檢測的試劑盒，包括熒光探針qPCR法支原體檢測試劑盒、一步恒溫顯色法支原體檢測試劑盒和巢式PCR法支原體檢測試劑盒。

其中，支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）(2G)是基于巢式PCR法(NestedPCR)對(duì)各種生物材料（如細(xì)胞培養(yǎng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分泌物和動(dòng)物血清等）支原體感染的檢測。該試劑盒采用定量PCR技術(shù)，針對(duì)支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩套引物，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，以第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物為準(zhǔn)進(jìn)行支原體污染情況判斷。其可檢出包括口腔支原體(M.orale)、肺炎支原體(M.pneumoniae)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、精氨酸支原體(M.arginini)、雞敗血支原體(M.gallisepticum)、關(guān)節(jié)液支原體(M.synoviae)、發(fā)酵支原體(M.fermentans)、檸檬螺原體(Spiroplasma citri)、唾液支原體(M.salivarium)等在內(nèi)的共34種支原體，靈敏度可達(dá)2.5 copies/μL，對(duì)于10 CFU/mL支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株也可正常擴(kuò)增有條帶，具備特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方便快速等特點(diǎn)，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液的檢測。

本產(chǎn)品相較于常規(guī)PCR法支原體檢測試劑盒，可避免由于引物與模板之間的非特異配對(duì)，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；還可靈敏的檢測到樣本中微量的支原體DNA，避免假陰性的產(chǎn)生。

本產(chǎn)品主要用在日常檢測用細(xì)胞或者研發(fā)早期的細(xì)胞的支原體快速檢測中。

1、本試劑盒第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物靈敏度為1x103 copies/μL：

2、本試劑盒第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物靈敏度為2.5 copies/μL：

1、檢測范圍：本2G版本巢式PCR支原體檢測試劑盒檢測了中外藥典要求的10CFU/mL靈敏度的共8種支原體，均可檢出。

PS：藥典要求的支原體滅活菌株DNA模板濃度為10CFU/mL，雞敗血支原體、萊氏無膽甾原體由于樣本不足未檢測

2、樣本基質(zhì)干擾：選取了14種常見樣品基質(zhì)和試劑盒中的陽性對(duì)照及其加標(biāo)（2.5copies/μL陽性對(duì)照）、陰性對(duì)照（PCR Mix）做驗(yàn)證，14種基質(zhì)均未檢出支原體。