GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts

Keywords: DNA damage response; GDF15; inflammatory mechanoresponse; orthodontic tooth movement; periodontal ligament fibroblasts; senescence; zoledronic acid.

在正畸牙齒移動(dòng)（OTM）期間，通過正畸矯治器施加機(jī)械力來促進(jìn)牙周膜（PdL）重塑和牙槽骨的生理適應(yīng)。這些力觸發(fā) PdL 細(xì)胞的機(jī)械生物學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)局部無菌和短暫的炎癥微環(huán)境，從而導(dǎo)致組織和骨骼重塑。因此，壓縮力通常通過誘導(dǎo)缺氧和激活牙周膜成纖維細(xì)胞（PdLFs）的促炎反應(yīng)來促進(jìn)骨吸收，包括增加細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL6、IL8 和環(huán)氧合酶2（COX2）。

生長(zhǎng)/分化因子15（GDF15）是 TGF-β/BMP 超家族的成員，在代謝、機(jī)械或化學(xué)應(yīng)激期間由各種細(xì)胞類型和組織釋放，在 OTM 中也起主要作用。GDF15 可在被機(jī)械刺激的人牙周膜成纖維細(xì)胞（hPdLFs）中上調(diào)，并促進(jìn)其促炎反應(yīng)。除了調(diào)節(jié) PdL 中成骨細(xì)胞分化和炎癥外，GDF15 還參與細(xì)胞死亡和細(xì)胞衰老以及衰老的調(diào)控。

OTM 可受到多種藥物的干擾，這些藥物也可能誘發(fā)影響骨吸收或附著過程的功能障礙。其中一種藥物是雙膦酸鹽類（BP）唑來膦酸（ZOL），主要用于治療癌性骨轉(zhuǎn)移、骨代謝疾病以及骨質(zhì)疏松癥。已有研究描述了ZOL 對(duì)幾種細(xì)胞類型細(xì)胞活力和增殖能力的影響，尤其是破骨細(xì)胞，其對(duì)DNA損傷反應(yīng)和衰老誘導(dǎo)的影響也在幾種細(xì)胞類型中得到闡釋。然而，OTM 期間 ZOL 對(duì) PdLFs 機(jī)械相關(guān)功能的確切影響尚未得到充分研究。

因此，德國(guó)耶拿大學(xué)附屬醫(yī)院口腔正畸科、保守牙科和牙周病學(xué)系老年牙科課題組的一項(xiàng)研究旨在表征 ZOL 對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的炎癥機(jī)械反應(yīng)的作用，并進(jìn)一步確定 GDF15 的潛在影響。研究成果發(fā)表在 CELLS 期刊題為“GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts”。

首先，評(píng)估了 hPdLFs 暴露于不同濃度 ZOL（0.5 μM、5 μM、50 μM）的反應(yīng)。MTT測(cè)定分析表明，與對(duì)照組相比，在為期兩天 ZOL 處理的 hPdLFs 中檢測(cè)到代謝活性水平降低（圖1 a），且最高的 ZOL 濃度導(dǎo)致較低的代謝活性。進(jìn)一步對(duì)hPdLFs 進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色（圖1 b），發(fā)現(xiàn)隨著 ZOL 濃度的增加，觀察到更多的臺(tái)盼藍(lán)-陽(yáng)性細(xì)胞，表明 ZOL 具有細(xì)胞毒作用。增殖標(biāo)志物 Ki67 免疫熒光染色顯示，隨著 ZOL 濃度的增加，增殖成纖維細(xì)胞的數(shù)量減少，表明 ZOL 對(duì) hPdLFs 細(xì)胞增殖具有限制作用（圖1 c、d）。

由于特定刺激會(huì)觸發(fā) PdL 成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，因此，研究了 ZOL 對(duì)其細(xì)胞命運(yùn)的影響。對(duì)成骨標(biāo)志基因 ALP 和 RUNX2 進(jìn)行定量表達(dá)分析（圖1 e、f），發(fā)現(xiàn)ZOL 處理 48 小時(shí)后未檢測(cè)到基因轉(zhuǎn)錄的顯著差異。此外，檢測(cè)了反映成骨細(xì)胞活性的 ALP 活性水平（圖1 g、h），與成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平一致，ZOL 暴露后也未觀察到鈣沉積的顯著變化。這些數(shù)據(jù)表明，唑來膦酸劑量依賴性地限制了 PdL 成纖維細(xì)胞的活力和增殖，而不會(huì)影響這些細(xì)胞的成骨分化。

圖1     唑來膦酸限制了人 PdL 成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力和增殖。

鑒于唑來膦酸對(duì)不同細(xì)胞類型中 DNA 損傷反應(yīng)（DDR）的影響以及這種應(yīng)激反應(yīng)在 PdL 健康和功能中的相關(guān)作用存在相互矛盾的結(jié)果，因此，接下來專注 ZOL 處理的 hPdLFs 中的 DDR 激活。

TUNEL法（斷裂DNA 分析）檢測(cè) ZOL 處理引起的 DNA 鏈斷裂，揭示了 DNA 損傷的劑量依賴性增加。磷酸化的 H2A.X 是 DDR 激活的標(biāo)志，免疫熒光染色顯示，ZOL 導(dǎo)致 hPdLFs 中 H2A.X 的磷酸化速率以劑量依賴性方式升高，這表明 hPdLFs 中的 DDR 激活增強(qiáng)。

DDR 信號(hào)的持續(xù)激活可能會(huì)觸發(fā)細(xì)胞衰老，損害 hPdLFs 的功能。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，對(duì)衰老相關(guān)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑 p21WAF1/CIP1/SDI1進(jìn)行了免疫熒光染色。由于 ZOL 暴露，在 hPdLFs 中檢測(cè)到 p21 強(qiáng)度的劑量依賴性增加（圖2 a、b），表明向衰老細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變。進(jìn)一步分析衰老相關(guān)標(biāo)志物 β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性，證實(shí)了 ZOL 處理的 hPdLFs 的衰老增加（圖2 c、d）。此外，檢測(cè)到衰老相關(guān)細(xì)胞因子如 IL6、IL8 和 COX2 的表達(dá)增加，以及 GDF15 表達(dá)的增加（圖2 e）。

這些數(shù)據(jù)表明，唑來膦酸通過誘導(dǎo) DNA 鏈斷裂來誘導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低并促進(jìn) hPdLFs 的細(xì)胞衰老。

圖2    ZOL 處理促進(jìn) hPdLFs 的細(xì)胞衰老。

向衰老表型的轉(zhuǎn)變可能會(huì)顯著影響 hPdLFs 的功能，這可能與在正畸牙齒移動(dòng)過程中組織和骨骼重塑相關(guān)。因此，研究人員旨在研究 ZOL（5 μM）對(duì) hPdLFs 機(jī)械反應(yīng)的影響，更具體地關(guān)注促炎過程的誘導(dǎo)和 OCs 的激活。

在施加 24 小時(shí)的壓縮力（2 g/cm2）后，確定 ZOL 處理的 hPdLFs 的炎癥機(jī)械反應(yīng)譜的差異，對(duì)編碼力調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子的基因進(jìn)行定量表達(dá)分析（圖3 a）。施加壓縮力后，檢測(cè)到所有分析基因（IL1B、IL6、IL8、COX2 和 GDF15）的表達(dá)水平增加（圖3 a）。雖然 IL8 和 COX2 沒有顯示 ZOL 依賴性變化，但 IL1B、IL6 和 GDF15 水平顯著增強(qiáng)，表明與 ZOL 相關(guān)的特異性促炎特征增強(qiáng)（圖3 a）。

為了從功能上檢查機(jī)械刺激的 ZOL 暴露的成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步研究了免疫細(xì)胞的激活（圖3 b、c）。在與刺激的 hPdLFs 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)感應(yīng)到促炎信號(hào)時(shí)，非貼壁單核細(xì)胞 THP1 細(xì)胞分化為貼壁巨噬細(xì)胞。因此，在壓縮刺激的 ZOL 處理的 hPdLFs中，貼壁 THP1 細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，證實(shí)了暴露于唑來膦酸的 PdL 成纖維細(xì)胞的高炎性機(jī)械反應(yīng)。

由于 GDF15 在調(diào)節(jié) hPdLFs 對(duì)壓縮刺激的促炎反應(yīng)中有重要功能，最后，研究了其在壓縮力下 ZOL 處理的 hPdLFs 過度炎癥反應(yīng)中的潛在作用。在ZOL 處理后，壓縮力刺激前使用 siRNA 介導(dǎo)的基因沉默敲低 GDF15，發(fā)現(xiàn)其RNA（圖3 d）、蛋白質(zhì)（圖3 e、f） 和分泌（圖3 g）表達(dá)降低。在 GDF15 缺失的情況下，壓縮力刺激的 hPdLFs 中，ZOL 誘導(dǎo)的 IL1B 和 IL6 表達(dá)增加被減弱（圖3 d）。此外，在 GDF15 缺失的 hPdLFs 中，ZOL 依賴性的免疫細(xì)胞活化上調(diào)被降低（圖3 h、i），這特別表明了 GDF15 在響應(yīng) ZOL 治療中具有深遠(yuǎn)的促炎作用。

這些數(shù)據(jù)表明，ZOL 改變的細(xì)胞特征確實(shí)會(huì)干擾 hPdLFs 的生物力學(xué)功能，并且 GDF15 在此過程中起著至關(guān)重要的作用。

圖3   ZOL 誘導(dǎo)了部分受 GDF15 調(diào)節(jié)的高炎癥機(jī)械反應(yīng)。

總之，該研究表明，唑來膦酸鈉可以通過直接抑制骨吸收細(xì)胞來抑制牙齒移動(dòng)，通過影響牙周膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞特性和機(jī)械生物學(xué)功能來間接影響它們的激活。研究證明了唑來膦酸特異性觸發(fā) DNA 損傷和細(xì)胞衰老，潛在性的觸發(fā)過度炎癥機(jī)械反應(yīng)，降低破骨細(xì)胞活化。然而，這可能會(huì)在雙膦酸鹽患者的正畸治療中引發(fā)潛在的負(fù)面作用。GDF15 作為促進(jìn)這些 ZOL 相關(guān)變化的潛在調(diào)節(jié)因子，將是未來OTM患者特異性治療策略的可能靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Nitzsche A, Hennig CL, von Brandenstein K, D?ding A, Schulze-Sp?te U, Symmank J, Jacobs C. GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts. Cells. 2024 Jan 12;13(2):147. doi: 10.3390/cells13020147. PMID: 38247838; PMCID: PMC10814077.

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