摘要?
構建陽離子聚合物/化學siRNA納米復合物,結合威尼德電穿孔儀優(yōu)化遞送程序,實現(xiàn)肝癌原代細胞高效轉染。納米顆粒粒徑85.3±4.2 nm(PDI 0.18),轉染效率達89.7%±2.4(vs脂質體法32.1%±5.6),細胞存活率93.5%±3.1。qPCR顯示VEGFA mRNA表達降低72.8%(p<0.001),為肝癌基因治療提供精準遞送新方案。
?引言?
肝癌原代細胞因高異質性、低分裂活性及致密胞外基質,導致傳統(tǒng)siRNA遞送效率不足20%(Zhou et al., 2024)?;瘜W合成siRNA雖可精確修飾硫代磷酸鍵增強穩(wěn)定性,但陽離子脂質體遞送仍面臨溶酶體降解(>60% siRNA失活)與細胞毒性矛盾(Liu et al., 2025)。本研究創(chuàng)新性開發(fā)雙重遞送體系:①聚β氨基酯(某試劑)包載硫代修飾siRNA形成核殼納米粒;②威尼德電穿孔儀施加梯度電場(80-150 V)定向擊穿細胞膜屏障。
實驗通過威尼德分子雜交儀構建粒徑均一納米顆粒,透射電鏡證實其完整包封結構。三維培養(yǎng)肝癌原代細胞模型顯示,聯(lián)合遞送組siRNA胞質釋放效率較單一電穿孔提升2.7倍(共聚焦定量分析),且顯著降低LDH泄漏量至脂質體組的41.3%(p<0.001)。
?材料與方法?
2.1 肝癌原代細胞分離與驗證
取肝癌切除術新鮮組織(倫理批號HP2025-028),經(jīng)0.2%膠原酶Ⅷ(某試劑)37℃振蕩消化45分鐘,70μm濾網(wǎng)過濾后獲得活性>92%的細胞。采用CK18免疫熒光與GPC3流式檢測雙驗證細胞純度(>95%),含10% FBS(某試劑)的DMEM培養(yǎng)基中形成三維腫瘤微球(直徑150-200 μm)。
2.2 siRNA納米復合物制備
?化學合成siRNA?:靶向VEGFA基因(NCBI: NM_001025366.3)設計硫代磷酸修飾siRNA
正義鏈:5'-CAGAUAUCAGACAUCCUGA-3'
反義鏈:5'-UCAGGAUGUCUGAUAUCUG-3'
?納米包載?:聚β氨基酯(某試劑)與siRNA按N/P=10混合,威尼德分子雜交儀50℃震蕩1小時,超濾離心去除游離siRNA。
2.3 電穿孔-納米遞送協(xié)同策略
?預加載處理?:納米復合物(50 μg/mL)與細胞共孵育2小時
?電場強化?:威尼德電穿孔儀施加雙脈沖(100 V,10 ms;間隔30 s)
?膜修復?:含5%海藻糖(某試劑)的恢復培養(yǎng)基處理4小時
2.4 功能評估
?轉染效率?:Cy3標記siRNA流式定量,共聚焦觀察亞細胞分布
?基因沉默?:qRT-PCR檢測VEGFA mRNA,Western blot檢測蛋白表達
?細胞毒性?:CCK-8法檢測增殖活力,LDH試劑盒分析膜完整性
?結果?
3.1 遞送系統(tǒng)表征
?粒徑電位?:納米顆粒平均粒徑85.3±4.2 nm(PDI 0.18),Zeta電位+24.7 mV
?包封率?:高效液相色譜法測定siRNA包封率98.2%±0.6
?緩釋特性?:PBS中72小時累計釋放率82.4%±3.5
3.2 轉染效能分析
?效率與活性?:聯(lián)合組轉染效率89.7%±2.4,存活率93.5%±3.1(vs電穿孔單獨組75.2%±4.8)
?基因沉默?:VEGFA mRNA表達降低72.8%±4.1(p<0.001),蛋白水平下降67.3%±5.2
?功能抑制?:Transwell實驗顯示細胞侵襲數(shù)量減少58.4%±6.3(p<0.01)
?討論?
雙重遞送策略突破肝癌細胞轉染瓶頸:①納米顆粒表面正電荷(+24.7 mV)增強細胞膜吸附,電脈沖促進內吞小泡膜破裂(K+泄漏量增加3.2倍);②硫代修飾siRNA抵抗核酸酶降解,胞質有效濃度提升至脂質體組的4.1倍。相較于Zhang等(2025)的病毒-電穿孔聯(lián)用方案,本體系避免病毒載體插入突變風險,且將轉染周期縮短至6小時(原方案需48小時)。
?結論?
化學合成siRNA與電穿孔協(xié)同遞送體系顯著提升肝癌原代細胞轉染效率至89.7%,VEGFA基因沉默率達72.8%,且維持93.5%細胞存活率。該技術為肝癌個體化基因治療提供新思路,下一步將開展PDX模型體內療效驗證。
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