NADPH Oxidase 4: Crucial for Endothelial Function under Hypoxia—Complementing Prostacyclin

Keywords: NADPH oxidase 4; PTGIS; endothelial function; human endothelial cells; hypoxia; laminar flow.

氧氣供應(yīng)不足是許多疾病的一個(gè)特征，尤其是心血管系統(tǒng)的疾病。大多數(shù)細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)是由缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）介導(dǎo)的。這些異二聚體轉(zhuǎn)錄因子由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成，能夠與缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，進(jìn)而能夠調(diào)節(jié)大量基因，以應(yīng)對(duì)低氧水平或低氧應(yīng)激。

一些研究支持缺氧和 NADPH 氧化酶4（NOX4）之間存在串?dāng)_。因此，缺氧已被證明可在腎、腦、肺、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和肺動(dòng)脈高壓患者的外膜成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo) NOX4。NOX4屬于NADPH氧化酶家族的成員之一，NADPH 氧化酶是血管中活性氧的主要來(lái)源，與各種心血管疾病密切相關(guān)。例如，它們?cè)谒ダ舷嚓P(guān)的內(nèi)皮功能障礙發(fā)展中發(fā)揮作用，并導(dǎo)致糖尿病的血管并發(fā)癥。

據(jù)報(bào)道，NOX4 可由前列腺素I2 （PGI2）（通常稱為前列環(huán)素）信號(hào)誘導(dǎo)。PGI2 是一種由花生四烯酸代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)激素，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞合成，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集的功能，在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。盡管PGI2在缺氧條件下血管舒張中的作用已被確認(rèn)，但在缺氧條件下，NOX4和PGI2之間的關(guān)系尚未明確。此外，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)在缺氧下利用氧氣產(chǎn)生過(guò)氧化氫的原因也令人困惑。

因此，德國(guó)德累斯頓工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院及附屬醫(yī)院內(nèi)臟及胸血管外科的課題組在一項(xiàng)研究中闡明了 NOX4 在缺氧下的作用，特別是與 PGI2 的關(guān)系。研究成果發(fā)表在 Antioxidants  期刊題為“NADPH Oxidase 4: Crucial for Endothelial Function under Hypoxia—Complementing Prostacyclin”。

研究人員將 NOX4 mRNA 的表達(dá)與人血管中前列腺素I2 合酶（PTGIS）的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。從外周動(dòng)脈疾病患者中獲取閉塞近端動(dòng)脈壁樣本，在極有可能缺氧的動(dòng)脈壁中，觀察到 NOX4 表達(dá)與 PTGIS mRNA 表達(dá)之間存在緊密相關(guān)性。然而，在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后患者左乳內(nèi)動(dòng)脈中，這些動(dòng)脈不受閉塞的影響，也未發(fā)現(xiàn) NOX4 和 PTGIS mRNA 表達(dá)之間的相關(guān)性。

此外，原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）在缺氧 8 小時(shí)后 NOX4 表達(dá)顯著增加，并在 16 小時(shí)和 24 小時(shí)持續(xù)升高（圖1 A）。這伴隨著缺氧后過(guò)氧化氫（H2O2）釋放的增加，但這在具有 shNOX4 的細(xì)胞中被消除（圖1 B）。同時(shí)，來(lái)自野生型（WT）小鼠的主動(dòng)脈在缺氧 24 小時(shí)后顯示 Nox4 mRNA 表達(dá)升高（圖1 C）。

在 HUVECs 中，缺氧 24 小時(shí)后PTGIS的 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（圖1 D），上清液中PGI2無(wú)酶促反應(yīng)水解生成的 6-keto-PGF1α 濃度增加（圖1 E）。WT 小鼠的主動(dòng)脈顯示，缺氧后 PTGIS mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)，這在 Nox4-/- 小鼠的主動(dòng)脈中也非常顯著（圖1 F）。放線菌素D 的實(shí)驗(yàn)表明，在常氧和缺氧條件下，NOX4 mRNA 和PTGIS mRNA 的降解沒(méi)有顯著差異（圖1 G、H）。這些證據(jù)證明，響應(yīng)缺氧的 NOX4 和 PTGIS 的 mRNA 水平的調(diào)節(jié)是在基因轉(zhuǎn)錄水平上控制的，而不是通過(guò) mRNA 穩(wěn)定性等轉(zhuǎn)錄后過(guò)程來(lái)控制的。

圖1    缺氧后人內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠主動(dòng)脈中NOX4和PTGIS表達(dá)增加。

DMOG是可滲透入細(xì)胞的HIF-1α脯氨酰羥化酶（HIF-PH）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。在常氧條件下，用DMOG處理人內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)增加內(nèi)源性缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）水平。在 DMOG 應(yīng)用后檢測(cè)到內(nèi)皮細(xì)胞中 NOX4（圖2 A）和 PTGIS（圖2 D）表達(dá)升高，表明 NOX4 和 PTGIS 在缺氧下表達(dá)的上調(diào)具有 HIF 依賴性。在缺氧下抑制亞基HIF1a 導(dǎo)致 NOX4 表達(dá)降低（圖2 B），但 PTGIS 表達(dá)沒(méi)有降低（圖2 E）。然而，抑制 HIF2a 顯著阻止了 PTGIS 在缺氧下的上調(diào)（圖2 F），而 NOX4 不受影響（圖2 C）。這表明，NOX4 和 PTGIS 受不同 HIFs 的調(diào)控。

接下來(lái)，評(píng)估缺氧和 Nox4 對(duì)血管功能的影響，分析了 WT 和 Nox4-/- 小鼠腸系膜動(dòng)脈的血管功能。WT 小鼠在缺氧條件下血管內(nèi)皮舒張功能下降，還檢測(cè)到過(guò)氧化氫釋放增加，但 Nox4-/- 小鼠沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。當(dāng)在缺氧條件下用過(guò)氧化氫清除劑過(guò)氧化氫酶孵育 WT 腸系膜動(dòng)脈時(shí)，內(nèi)皮功能進(jìn)一步改變。此外，與 WT 小鼠相比，Nox4-/- 小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張進(jìn)一步下降。

下一步，將缺氧條件下 WT 小鼠的腸系膜動(dòng)脈與環(huán)氧合酶抑制劑雙氯芬酸一起孵育，深入了解前列腺素的影響，發(fā)現(xiàn)其血管舒張不受雙氯芬酸的影響。然而，與過(guò)氧化氫酶和雙氯芬酸聯(lián)合孵育的 WT 小鼠的腸系膜動(dòng)脈顯示出了內(nèi)皮功能障礙。同樣，在缺氧條件下，Nox4-/- 小鼠腸系膜動(dòng)脈用雙氯芬酸孵育后，內(nèi)皮功能障礙加劇。用一氧化氮合酶抑制劑 L-NAME 孵育腸系膜動(dòng)脈表明，同樣在缺氧條件下，內(nèi)皮依賴性血管舒張主要由一氧化氮介導(dǎo)，盡管這種影響在 Nox4-/- 小鼠的腸系膜動(dòng)脈中顯著增加，表明 Nox4 與內(nèi)皮依賴性血管舒張相關(guān)。此外，用過(guò)氧化氫酶和 L-NAME 孵育 HUVECs 顯示 eNOS mRNA 表達(dá)下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，Nox4 釋放的過(guò)氧化氫在缺氧下可維持內(nèi)皮功能。

圖2    NOX4 和 PTGIS 受不同 HIFs 的調(diào)控。

最后，為了研究保護(hù)性血流如何影響 NOX4 和 PTGIS 在缺氧下的上調(diào)，在缺氧條件結(jié)合 30 dyn/cm2 的高幅度層流下培養(yǎng)人內(nèi)皮細(xì)胞以模擬恢復(fù)的血流。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞在層流條件下處理24小時(shí)和48 小時(shí)時(shí)，缺氧條件下，NOX4的上升趨勢(shì)明顯降低（圖3 A、B）。同樣，PTGIS mRNA 表達(dá)也顯著降低（圖3 C、D）。相比之下，當(dāng)在缺氧條件下施加剪切應(yīng)力時(shí)，已知誘導(dǎo) eNOS 表達(dá)的層流剪切應(yīng)力仍導(dǎo)致 eNOS mRNA 表達(dá)上調(diào)（圖3 E、F）。然而，在缺氧條件下，由于層流刺激，eNOS 蛋白表達(dá)和一氧化氮釋放僅趨于增加（圖3 E、G）。相反，在那些施加額外層流的缺氧內(nèi)皮細(xì)胞中，觀察到 HIF1a 蛋白表達(dá)顯著降低（圖3 F）。這些結(jié)果表明，恢復(fù)的層流可阻止缺氧條件下 NOX4 和 PTGIS 的上調(diào)。

圖3    30 dyn/cm2的層流作用于人內(nèi)皮細(xì)胞，可阻止缺氧條件下NOX4和PTGIS的上調(diào)。

目前的研究提供了缺氧條件下NOX4和PGI2產(chǎn)生PTGIS酶相關(guān)的證據(jù)，觀察到 NOX4 受 HIF1a 調(diào)控，而 PTGIS 受 HIF2a 誘導(dǎo)。表明了NOX4 在缺氧下介導(dǎo)內(nèi)皮功能，從而補(bǔ)充血管中 PGI2，而層流剪切應(yīng)力恢復(fù)了 eNOS 表達(dá)并減弱了缺氧下 NOX4 和 PTGIS 的反應(yīng)?？傊?，該研究證明了NOX4 對(duì)于確保缺氧下內(nèi)皮依賴性血管舒張至關(guān)重要。因此，NOX4 作為過(guò)氧化氫的主要來(lái)源之一，可能有助于增強(qiáng)血管功能，恢復(fù)缺氧條件下的血液循環(huán)。目前探索用于治療纖維化和某些癌癥等疾病的 NOX4 抑制劑可能需要驗(yàn)證心血管副作用。

參考文獻(xiàn)：Brendel H, Mittag J, Hofmann A, Hempel H, Giebe S, Diaba-Nuhoho P, Wolk S, Reeps C, Morawietz H, Brunssen C. NADPH Oxidase 4: Crucial for Endothelial Function under Hypoxia-Complementing Prostacyclin. Antioxidants (Basel). 2024 Sep 27;13(10):1178. doi: 10.3390/antiox13101178. PMID: 39456432; PMCID: PMC11504732.

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